合成した化合物をNMRで確認したら、見覚えのないピークが出ていた。翌日にもう一度測ったら、目的物のシグナルがさらに減っていた――。そんな経験はありませんか？

「カラムで単離したときはきれいだったのに……」と自分の精製や化合物の安定性を疑う前に、ぜひ一度疑ってほしいものがあります。NMR溶媒そのものです。

有機化学者が毎日のように使う重クロロホルム（CDCl₃）は、光や酸素にさらされると少しずつ分解し、塩化重水素（DCl）とホスゲン（COCl₂）を生じます。つまり、私たちが「中性の溶媒」と思い込んでいるCDCl₃は、気づかないうちにわずかに酸性になっていることがあるのです。

今回は「いまさら聞けない？」実験シリーズとして、重クロロホルムが酸性になる理由と、酸に弱い化合物を守るための簡単な対策を、2022年に報告された検証論文とあわせて紹介します。

重クロロホルムはなぜ酸性になるのか

クロロホルムが光と酸素で分解し、有毒なホスゲンを生じることは古くから知られています。重水素化体でも事情は同じで、光・酸素・微量の水分のもとでラジカル的に分解し、全体としては次の反応が進みます。

2 CDCl₃ + O₂ → 2 COCl₂ + 2 DCl

ここで生じるDClは強酸です。またホスゲンは、それ自体が強い求電子剤です。つまり分解が進んだCDCl₃は、「酸」と「アシル化剤」を微量含んだ溶媒になっている、と考えると分かりやすいでしょう。

銀箔はなぜ入っているのか？

汎用のクロロホルムには、安定化剤としてエタノール（約0.5〜1%）やアミレンが加えられています。しかしNMR溶媒にこれらを入れると、そのままシグナルとして映り込んでしまいます。そこで市販のCDCl₃の多くは、銀箔（約0.5 wt%）を安定化剤として含んだ褐色瓶で売られています。銀がラジカルや塩化物を捕まえることで、分解を遅らせる仕組みです。ただし、あくまで「遅らせる」だけです。開封後に光や空気に何度もさらされた瓶では、少しずつ酸がたまっていきます。

関東化学製・重クロロホルムのラベル。「銀箔入」の表記が見える（こちらより引用）

ちなみに、研究室でよくある「大容量で買って、共用の瓶を何か月も使い続ける」運用は、まさにこの分解が進みやすい典型です。ですので重クロロホルムに関しては、長期保管を想定した使用は非推奨です。年度ごとのキャンペーンでまとめ買いして、半年～1年で使い切る程度の運用を考えておくのが好ましいです。

酸性のCDCl₃で何が起きるのか

影響は大きく「化合物が壊れる」「スペクトルが変わる」の2つに分けられます。

特に注意が必要となるのは、「測定に時間がかかる」「サンプルをそのまま一晩置く」ケースです。例えば¹³C NMRの多数回積算や、2次元NMRを一晩かけて測るときなどで、「¹Hを測ったときはきれいだったのに、¹³Cを測り終えたら分解していた」というパターンがあるあるです。

ほかに注意が必要となるのは、幾つものサンプルを比べる解析です。化合物が壊れなくても、酸性度が瓶ごと、日ごとに違うと、シグナルの位置が微妙にずれます。定量NMRや、スペクトル全体を「指紋」として比べるメタボロミクス的な解析では、このずれがそのままデータのばらつきになります。

重クロロホルム取扱いの三原則

では、どうすればよいのでしょうか。やることはどれも簡単です。

1．酸に弱いサンプルでは、溶かす直前に中和する

塩基性活性アルミナ、または乾燥した無水炭酸カリウムを少量詰めたパスツールピペットに、CDCl₃を通してから使うことで、この酸問題は解決できます。DClとホスゲンが取り除かれ、そのままサンプルを溶かせます。

ただし、通すのは溶媒だけにしましょう。サンプルを溶かした後にアルミナを通すと、極性の高い化合物は吸着されて回収できなくなることがあります。

2．溶媒は冷暗所・小分けで保管する

光と酸素で分解が進むという原理を理解していれば、適切な保管・管理で分解を遅らせることも可能です。重要なのは下記の観点です。

• 褐色瓶のまま冷蔵庫で保管する：使うときは室温に戻してから開け、結露で水が入るのを防ぎます。
• 大きな瓶を買わない。何か月も開け閉めしたものを使わない：酸に弱い化合物をよく扱うなら、小容量の瓶やアンプルを使うと安心です。
• 開封日をラベルに書いておく：共用の瓶では特に有効です。

3．怪しいと思ったらまず確認！疑わしい場合は溶媒を変える

酸性度は簡単に確かめられます。CDCl₃を中性の水とBTB（ブロモチモールブルー）と一緒に振り、水層が黄色になれば酸がたまっています。

そもそも酸に弱いことが分かっている化合物なら、C₆D₆ややアセトン-d₆など、別の重溶媒で測るのも立派な対策です。また、測定が終わったサンプルは放置せず、早めに濃縮して回収しましょう。

「中和すると本当に変わるの？」―2022年の検証論文

「アルミナに通すとよい」というコツは、研究室で口伝として伝わっていることが多く、効果を定量的に示した報告は意外と少ないものです。そこを真正面から調査対象にしたのが、ドイツ・カールスルーエ 化学・獣医試験所のグループによる論文です。

“An Easy and Reliable Method for the Mitigation of Deuterated Chloroform Decomposition to Stabilise Susceptible NMR Samples”
Teipel, J.; Gottstein, V.; Hölzle, E.; Kaltenbach, K.; Lachenmeier, D. W.; Kuballa, T. Chemistry 2022, 4, 776–785. DOI: 10.3390/chemistry4030055

著者らは、食品から抽出した脂質をCDCl₃に溶かしてNMRで比べる分析を行っています。その中で、同じ試料なのにシグナルの位置や形が揃わないという問題に直面しました。原因として疑ったのが、CDCl₃の分解で生じる酸とホスゲンです。

提案された処理法

1. CDCl₃を、過剰の約10%炭酸ナトリウム水溶液と強く振り混ぜる（数分間）。
2. 分取したCDCl₃に無水炭酸ナトリウム（Na₂CO₃）を加えて振り、一晩置いて乾燥させる。
3. 使う直前にPTFE製のフィルターでろ過する。

つまり「塩基で洗って、塩基で乾かして、そのまま保管する」という、拍子抜けするほど単純な方法です。塩基性アルミナで処理する方法もあわせて試されています。

結果

• 未処理のCDCl₃では、卵黄脂質の抽出物でシグナルが0.01〜0.03 ppmずれる。
• 処理したCDCl₃では、トラウト試料でばらつきが0.01 ppm以下に収まる。コーヒー試料ではシグナルのずれが見られなくなる。多くのシグナルで、化学シフトの標準偏差が小さくなる。
• 乾燥時間は重要で、15分程度では水が残り、一晩置くと水のシグナルが小さく鋭くなる。
• 炭酸ナトリウムと一緒に保管すれば、少なくとも1週間は効果が保たれる。

異なるバッチ由来の卵黄脂質抽出物 ¹H-NMR スペクトル13種の重ね合わせ。拡大図から、微妙に化学シフト値が異なっていることが見て取れる。溶媒：未処理クロロホルム-d/メタノール-d₄(3/2、v/v)　[Chemistry 2022, 4, 776より引用]

なお著者らは、この方法がエタノールや銀箔などの既存の安定化剤より有効だと結論しています（ただし、その比較を詳しく行っているわけではないことには留意が必要です）。

おわりに

重クロロホルムはあまりに身近で、単なる測定溶媒として扱われてしまうあまり、ことさら意識されにくい存在です。しかしその実態は、酸とホスゲンを生み続ける試薬でもあります。

「NMRを測ったら壊れていた」場合には、化合物や自分の操作を疑う前に、まず溶媒を疑ってみましょう。パスツールピペット一本分の手間で、大切なサンプルを守れるかもしれません。研究室の新人教育のネタとしても、ぜひご活用ください。

参考文献・関連記事・関連リンク

参考文献

1. Teipel, J.; Gottstein, V.; Hölzle, E.; Kaltenbach, K.; Lachenmeier, D. W.; Kuballa, T. “An Easy and Reliable Method for the Mitigation of Deuterated Chloroform Decomposition to Stabilise Susceptible NMR Samples” Chemistry 2022, 4, 776–785. DOI: 10.3390/chemistry4030055
2. Tsujikawa, K., Segawa, H., Kuwayama, K. et al. Phosgene in deteriorated chloroform: presumptive cause of production of 3,4-dimethyl-5-phenyl-2-oxazolidones in methamphetamine. Forensic Toxicol. 2020, 38, 475–480. DOI: 10.1007/s11419-019-00517-7
3. Fulmer, G. R. et al. “NMR Chemical Shifts of Trace Impurities: Common Laboratory Solvents, Organics, and Gases in Deuterated Solvents Relevant to the Organometallic Chemist” Organometallics 2010, 29, 2176–2179. DOI: 10.1021/om100106e

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関連リンク

• Sigma-Aldrich：NMR Chemical Shifts of Impurities（不純物シフト表）