筆者が学部生の頃、タンパク質の結晶化は非常に難しいと授業で教わりました。
タンパク質の結晶化は職人技だ！と。
しかし、タンパク質の結晶化は年々簡便になってきています。また、最近の酵素工学の論文を見ていると、近い将来タンパク質の結晶構造は必須になるのでは？と思います。
今回は、血液中のコレステロール値を低下させる薬としても有名なロバスタチンの生合成に関わるLovCという還元酵素についての論文を紹介します。この論文では、LovCの結晶、変異酵素の結晶、補酵素や基質との共結晶など様々な結晶を基に、反応機構、タンパク質間相互作用について議論しています。
’’Crystal structure and biochemical studies of the trans-acting polyketide enoyl reductase LovC from lovastatin biosynthesis’’
Brian D. Ames, Chi Nguyen, Joel Bruegger, Peter Smith, Wei Xu, Suzanne Ma, Emily Wong, Steven Wong, Xinkai Xie, Jesse W.-H. Li, John C. Vederas, Yi Tang and Shiou-Chuan Tsai
PNAS 2012, 109, 11144-11149. DOI : 10.1073/pnas.1113029109
Lovastatinの生合成
Lovastatinの生合成経路はきわめてシンプルです。
TypeI PKSであるLovBとEnoyl ReductaseであるLovCの主に二つの酵素でLovastatinの骨格を作りあげ、そこへ、LovFによって作られた側鎖がLovDにより縮合するというものです。
この生合成経路の中で注目すべき点は、LovBとLovCによって触媒される反応です。
この二つの酵素について以下の2点が注目されていました。
- LovBによって生合成されるnonaketide中間体は8つのケト部分構造を持つのに、なぜLovCはそのうちの3つのみを認識して還元できるのか？
- LovBとLovCはcomplexを形成しているのか？
enoyl reductaseって何？
type I PKSは、複数のドメインが一つのポリペプチド上に連なった酵素です。ドメインには、KS, DH, AT, ACP, KR, MT, ER, TEなどがあります。ERは、下記の反応式に示すように二重結合の還元反応を触媒するドメインです。
今回取り上げるER(LovC)は、type I PKS (LovB)のポリペプチド上に無く、LovBとは別のタンパク質として存在しているにも関わらず、LovBのいくつかのモジュールの反応に関与しています。このようにモジュールの外側に存在しているにもかかわらず、反応に関わってくるものをtrans-actingと言います。trans ER以外に、trans ATなどもよく知られています。
LovCの構造
LovCはmedium-chain dehydrogenase/reductase(MDR) super familyというタンパク質群に属しています。ほぼ全てのMDRがdimerなのに対して、LovCはmonomerとして存在しています。
また、他のMDRに比べてLovCは、余分な領域を持っています。（上図A中のxL1とxL2）
このように、LovCはMDR super familyに属する他のタンパク質の構造と大きく異なっているため、分子置換法により結晶構造を解くことはできなかったようです。（今回の論文では、重原子置換法を用いています。）おそらく、ホモロジーモデルも作れなかったのではないでしょうか。
また、LovCは基質の結合の有無によりopen formとclosed formをとります。NADPHが結合している状態ではopen form。ここにさらに基質が結合するとTyr296(xL2部分)が内側に倒れて、closed formになります。open formからclosed formに変化することによって、タンパク質表面の電荷状態も大幅に変化するようです。
LovBとLovCのタンパク質間相互作用
LovBとLovCのタンパク質間相互作用は昔から提唱されていました。しかし、どのように複合体を形成しているかは謎でした。今回、筆者らは、サイズ排除クロマトグラフィーでLovBとLovCが複合体を形成していることをまず確かめました。
LovBには、機能していないERドメインが一つあります。この事実と、LovCはMDR super familyに属しているにも関わらずmonomerで存在しているということ、LovCとLovBのERドメインの相同性が高いことより、
LovCはLovBのERドメインとhetero dimerを形成しているのではないか？
LovCがmonomerで存在しているのはhetero dimerを作るためでは無いのか？
と論文著者らは予想しました。
そこで、LovBのERドメインのみをクローニングしてタンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィーで相互作用を調べましたが、LovCとはhetero dimerを形成しませんでした。
論文著者らは、LovCとLovBのタンパク質間相互作用にはER以外のドメインも関わっているのではないかと考えました。そこで、LovBのホモロジーモデルとLovCの結晶構造とでドッキングシミュレーションを行なうと、LovBのACPドメインとLovCが非常に近い位置にあることが分かりました。タンパク質の表面電荷からもLovCのactive siteとLovBのACPドメインは相互作用することが裏付けられています。
結論として、LovCはLovBのACPドメイン、ERドメインと相互作用しています。
LovCの反応機構
今回の実験結果よりLovCの反応機構は以下の図のように推定されました。（細かい実験結果は、論文を参照してください）
1. 基質が結合する前に、NADPHがLovCに結合する。
2. これによりLovCの構造が変化しLovBと結合しやすくなる。
3. LovBのACPドメインがLovCのK54付近の正電荷を帯びているタンパク表面と相互作用し、複合体を形成する。
4. 基質がACPよりLovCに受け渡される。
5. NADPHのヒドリドが基質のC3位を攻撃。
6. 中間体であるエノラートがLovC中のオキシアニオンホールにより安定化される。
7. 基質のC2が水の水素原子を奪い、還元反応が終了する。
8. LovCから基質が放出され、LovBとの複合体形成を解消する。
また、論文著者達はドッキングシミュレーションによりLovCの基質特異性についても議論しています。
実験結果より、LovCが受け入れることができるのは、tetraketide, pentaketide, heptaketideのみです。他のpolyketide中間体はなぜ受け入れられないのでしょうか？その理由は以下のように述べられています。
diketideやtriketideのような炭素鎖の短い基質では、NADPHと基質の二重結合部分がうまく近づかない。
また、hexaketideでは、LovCの反応よりもDiels Alder反応の方が優先される。
heptaketideよりも長い炭素鎖の基質は、酵素のキャビティ容積の関係上、キャビティ内に入らない。
今回の研究の位置づけ
LovBとLovCのタンパク質間相互作用は、Vederas本人によって30年以上前に提唱されていましたが、今回の論文で初めて証明されました。やはり、タンパク質の結晶構造には説得力があります。
今回紹介した論文はPNASに掲載された論文でした。Vederas, Yi-Tang, Tsaiの3研究室合同の研究ということもあり、データ量、内容ともに充実したものでした。明らかに、PNASより上の雑誌を狙って失敗したという印象を受けました。（量が多すぎたので、今回のつぶやきの記事では、論文のかなりの部分を省略して紹介しました。結果としてまとまりの無い記事になってしまいました。）
今回の論文で、より上の雑誌を目指すために足りなかったのは、変異実験についての考察だと思います。あるアミノ酸残基を変えることで酵素の機能がガラッと変化すれば結論付けが楽なのですが、今回の論文中の変異実験の結果はどれも微妙なものでした。
今回、LovCの構造が明らかになったことでLovBのACPとの相互作用部位などが分かりました。LovCの配列を用いてBLAST検索することにより他のカビのtrans-acting ERも見つけることができるようになりました。そこからさらに、trans acting ERと相互作用するType I PKSを見つけ出すことも可能になりました。
つまり、今回の論文の成果は、ロバスタチンの生合成研究にのみ還元されるものではなく、その他多くのカビの代謝産物の研究にとって重要なものです。今後のカビの二次代謝産物の生合成研究に大いに貢献すると思います。
最後に
今回紹介したような酵素を論文で見るたびに、生体の反応制御の精巧さに驚かされます。酵素活性部位を模倣した触媒というものが、多数開発されていますが、まだ酵素には及ばないように思います。酵素の反応制御のすごさと言うのは、活性中心のみだけでなく、それ以外の部分にも現れています。
タンパク質間相互作用により、他の酵素との基質のやり取りを容易にしたり、基質の結合によりopen form, closed formを切り替えたりと、本当に良くできていると毎度感嘆させられます。
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