[スポンサーリンク]

化学者のつぶやき

結晶構造に基づいた酵素機能の解明ーロバスタチン生合成に関わる還元酵素LovCー

[スポンサーリンク]

 

筆者が学部生の頃、タンパク質の結晶化は非常に難しいと授業で教わりました。

タンパク質の結晶化は職人技だ!と。

 

しかし、タンパク質の結晶化は年々簡便になってきています。また、最近の酵素工学の論文を見ていると、近い将来タンパク質の結晶構造は必須になるのでは?思います。

今回は、血液中のコレステロール値を低下させる薬としても有名なロバスタチンの生合成に関わるLovCという還元酵素についての論文を紹介します。この論文では、LovCの結晶、変異酵素の結晶、補酵素や基質との共結晶など様々な結晶を基に、反応機構、タンパク質間相互作用について議論しています。

 

’’Crystal structure and biochemical studies of the trans-acting polyketide enoyl reductase LovC from lovastatin biosynthesis’’

Brian D. Ames, Chi Nguyen, Joel Bruegger, Peter Smith, Wei Xu, Suzanne Ma, Emily Wong, Steven Wong, Xinkai Xie, Jesse W.-H. Li, John C. Vederas, Yi Tang and Shiou-Chuan Tsai

PNAS, 109 (28) 11144-11149(2012) DOI : 10.1073/pnas.1113029109

Lovastatinの生合成

2015-08-15_23-35-13

Lovastatinの生合成経路はきわめてシンプルです。

TypeI PKSであるLovBとEnoyl ReductaseであるLovCの主に二つの酵素でLovastatinの骨格を作りあげ、そこへ、LovFによって作られた側鎖がLovDにより縮合するというものです。

 

この生合成経路の中で注目すべき点は、LovBLovCによって触媒される反応です。

この二つの酵素について以下の2点が注目されていました。

 

  • LovBによって生合成されるnonaketide中間体は8つのケト部分構造を持つのに、なぜLovCはそのうちの3つのみを認識して還元できるのか?
  • LovBLovCはcomplexを形成しているのか?

 

enoyl reductaseって何?

type I PKSは、複数のドメインが一つのポリペプチド上に連なった酵素です。ドメインには、KS, DH, AT, ACP, KR, MT, ER, TEなどがあります。ERは、下記の反応式に示すように二重結合の還元反応を触媒するドメインです。

enoyl reductase.png

 

今回取り上げるER(LovC)は、type I PKS (LovB)のポリペプチド上に無く、LovBとは別のタンパク質として存在しているにも関わらず、LovBのいくつかのモジュールの反応に関与しています。このようにモジュールの外側に存在しているにもかかわらず、反応に関わってくるものをtrans-actingと言います。trans ER以外に、trans ATなどもよく知られています。

 

LovCの構造

 

LovCはmedium-chain dehydrogenase/reductase(MDR) super familyというタンパク質群に属しています。ほぼ全てのMDRがdimerなのに対して、LovCはmonomerとして存在しています。

また、他のMDRに比べてLovCは、余分な領域を持っておいます。(上図A中のxL1xL2

このように、LovCはMDR super familyに属する他のタンパク質の構造と大きく異なっているため、分子置換法により結晶構造を解くことはできなかったようです。(今回の論文では、重原子置換法を用いています。)おそらく、ホモロジーモデルも作れなかったのではないでしょうか。

 

また、LovCは基質の結合の有無によりopen formclosed formをとります。NADPHが結合している状態ではopen form。ここにさらに基質が結合するとTyr296(xL2部分)が内側に倒れて、closed formになります。open formからclosed formに変化することによって、タンパク質表面の電荷状態も大幅に変化するようです。

 

LovBとLovCのタンパク質間相互作用

 

LovBとLovCのタンパク質間相互作用は昔から提唱されていました。しかし、どのように複合体を形成しているかは謎でした。今回、筆者らは、サイズ排除クロマトグラフィーでLovBとLovCが複合体を形成していることをまず確かめました。

size exclusion chromatograpy.gif

 

LovBには、機能していないERドメインが一つあります。この事実と、LovCはMDR super familiyに属しているにも関わらずmonomerで存在しているということ、LovCとLovBのERドメインの相同性が高いことより、

LovCはLovBのERドメインとhetero dimerを形成しているのではないか?

LovCがmonomerで存在しているのはhetero dimerを作るためでは無いのか?

と論文著者らは予想しました。

 

そこで、LovBのERドメインのみをクローニングしてタンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィーで相互作用を調べましたが、LovCとはhetero dimerを形成しませんでした。

 

論文著者らは、LovCとLovBのタンパク質間相互作用にはER以外のドメインも関わっているのではないかと考えました。そこで、LovBのホモロジーモデルとLovCの結晶構造とでドッキングシミュレーションを行なうと、LovBのACPドメインとLovCが非常に近い位置にあることが分かりました。

LovB ACP-LovC.gif

上図左側が、LovBのACPドメインのホモロジーモデル。右側がLovCと基質の共結晶。タンパク質の表面電荷からもLovCのactive siteとLovBのACPドメインは相互作用することが裏付けられています。

結論として、LovCはLovBのACPドメイン、ERドメインと相互作用しています。

 

LovCの反応機構

今回の実験結果よりLovCの反応機構は以下の図のように推定されました。(細かい実験結果は、論文を参照してください)

2015-08-15_23-39-24

 

 

1. 基質が結合する前に、NADPHがLovCに結合する。

2. これによりLovCの構造が変化しLovBと結合しやすくなる。

3. LovBのACPドメインがLovCのK54付近の正電荷を帯びているタンパク表面と相互作用し、複合体を形成する。

4. 基質がACPよりLovCに受け渡される。

5. NADPHのヒドリドが基質のC3位を攻撃。

6. 中間体であるエノラートがLovC中のオキシアニオンホールにより安定化される。

7. 基質のC2が水の水素原子を奪い、還元反応が終了する。

8. LovCから基質が放出され、LovBとの複合体形成を解消する。

 

 

また、論文著者達はドッキングシミュレーションによりLovCの基質特異性についても議論しています。

実験結果より、LovCが受け入れることができるのは、tetraketide, pentaketide, heptaketideのみです。他のpolyketide中間体はなぜ受け入れられないのでしょうか?その理由は以下のように述べられています。

diketideやtriketideのような炭素鎖の短い基質では、NADPHと基質の二重結合部分がうまく近づかない。

また、hexaketideでは、LovCの反応よりもDiels Alder反応の方が優先される。

heptaketideよりも長い炭素鎖の基質は、酵素のキャビティ容積の関係上、キャビティ内に入らない。

 

今回の研究の位置づけ

LovBとLovCのタンパク質間相互作用は、Vederas本人によって30年以上前に提唱されていましたが、今回の論文で初めて証明されました。やはり、タンパク質の結晶構造には説得力があります。

 

今回紹介した論文はPNASに掲載された論文でした。Vederas, Yi-Tang, Tsaiの3研究室合同の研究ということもあり、データ量、内容ともに充実したものでした。明らかに、PNASより上の雑誌を狙って失敗したという印象を受けました。(量が多すぎたので、今回のつぶやきの記事では、論文のかなりの部分を省略して紹介しました。結果としてまとまりの無い記事になってしまいました。)

今回の論文で、より上の雑誌を目指すために足りなかったのは、変異実験についての考察だと思います。あるアミノ酸残基を変えることに酵素の機能がガラッと変化すれば結論付けが楽なのですが、今回の論文中の変異実験の結果はどれも微妙なものでした。

 

今回、LovCの構造が明らかになったことでLovBのACPとの相互作用部位などが分かりました。LovCの配列を用いてBLAST検索することにより他のカビのtrans-acting ERも見つけることができるようになりました。そこからさらに、trans acting ERと相互作用するType I PKSを見つけ出すことも可能になりました。

つまり、今回の論文の成果は、ロバスタチンの生合成研究にのみ還元されるものではなく、その他多くのカビの代謝産物の研究にとって重要なものです。今後のカビの二次代謝産物の生合成研究に多いに貢献すると思います。

 

最後に

今回紹介したような酵素を論文で見るたびに、生体の反応制御の精巧さに驚かされます。酵素活性部位を模倣した触媒というものが、多数開発されていますが、まだ酵素には及ばないように思います。酵素の反応制御のすごさと言うのは、活性中心のみだけでなく、それ以外の部分にも現れています。

タンパク質間相互作用により、他の酵素との基質のやり取りを容易にしたり、基質の結合によりopen form, closed formを切り替えたりと、本当に良くできていると毎度感嘆させられます。

 

関連書籍

ゼロ

ゼロ

投稿者の記事一覧

女の子。研究所勤務。趣味は読書とハイキング ♪
ハンドルネームは村上龍の「愛と幻想のファシズム」の登場人物にちなんでま〜す。5 分後の世界、ヒュウガ・ウイルスも好き!

関連記事

  1. 「えれめんトランプ2.0」が発売された
  2. 結晶データの登録・検索サービス(Access Structure…
  3. 理想のフェノール合成を目指して~ベンゼンからフェノールへの直接変…
  4. 高分子と高分子の反応も冷やして加速する
  5. e.e., or not e.e.:
  6. 2009年ノーベル化学賞『リボソームの構造と機能の解明』
  7. 周期表の形はこれでいいのか? –その 1: H と He の位置…
  8. (−)-Salinosporamide Aの全合成

コメント、感想はこちらへ

注目情報

ピックアップ記事

  1. 東海カーボンと三菱化学、カーボンブラックの共同会社を断念
  2. 特定の刺激でタンパク質放出速度を制御できるスマート超分子ヒドロゲルの開発
  3. アーサー・C・コープ賞・受賞者一覧
  4. 留学生がおすすめする「大学院生と考える日本のアカデミアの将来2020」
  5. ランディ・シェックマン Randy Schekman
  6. 有機合成化学協会誌2019年7月号:ジアステレオ選択的Joullié-Ugi三成分反応・(-)-L-755,807 の全合成・結晶中構造転移・酸素付加型反応・多孔性構造体
  7. 「フラストレイティド・ルイスペアが拓く革新的変換」ミュンスター大学・Erker研より
  8. 2010年人気記事ランキング
  9. 水素製造に太陽光エネルギーを活用 -エタノールから水素を獲得し水素ガスを発生する有機化合物を開発-
  10. 植村酸化 Uemura Oxidation

関連商品

ケムステYoutube

ケムステSlack

注目情報

注目情報

最新記事

不溶性アリールハライドの固体クロスカップリング反応

第305回のスポットライトリサーチは、北海道大学大学院工学研究院 (伊藤研究室)・瀬尾 珠恵さんにお…

化学のためのPythonによるデータ解析・機械学習入門

hodaです。今回は筆者の勉強用に読んだ機械学習関連の書籍を紹介します。概要本書は、…

アカデミックから民間企業へ転職について考えてみる 第三回

カデミックから民間企業へ転職した場合、入社後にギャップを感じる人が少なからずいます。もちろん、どんな…

第142回―「『理想の有機合成』を目指した反応開発と合成研究」山口潤一郎 教授

第142回の化学者インタビューは日本から、皆さんご存じ、山口潤一郎教授の登場です。名古屋大学理学部化…

【書籍】ゼロからの最速理解 プラスチック材料化学

今月発売された『ゼロからの最速理解 プラスチック材料化学』(佐々木 健夫 著,コロナ社)という書籍を…

重水は甘い!?

同位体はある元素、すなわち同一の原子番号をもつ原子核において、中性子数の異なる核種のことをいいますね…

人物でよみとく化学

概要化学の歴史をつくった約50人を収録。高校・大学の化学の勉強に役立つ16テーマをあつかい、…

金属ナトリウム分散体(SD Super Fine ™)

概要金属ナトリウム分散体(SD Super Fine ™)は、金属ナトリウムの微粒…

Chem-Station Twitter

PAGE TOP