原理
もっとも古典的な比色定量法である。
アミノ酸が3つ以上繋がったトリペプチド以上のオリゴペプチド・タンパク質を、アルカリ条件下でCu2+を反応させると、Cu+となってペプチド結合を赤紫色の複合体を形成する。ペプチド結合の数が多くなると強く呈色する。この現象を利用して、540 nmにおける吸光度を測定し、検量線を用いて定量する。錯形成がビウレット―銅錯体と類似しているため、この反応名が付けられている。
Lowry法やBCA法はこれを改良したものに相当する。
長所
- タンパク質組成の違いによる影響を受けにくい
- 操作が簡便
- 界面活性剤・脂質の影響を受けにくい
短所
- 測定範囲は1-10 mg/mL、感度は低い
- 高濃度のTrisやアンモニウムイオンによって発色が影響される
プロトコル
Biuret試薬の調製法
CuSO4･5H2O（3 g）、酒石酸ナトリウムカリウム（12 g）、MQ水（500 mL）を混ぜて攪拌しながら、10% NaOH（600 mL)、ヨウ化カリウム (4 g)を加え、MQ水で2 Lにメスアップする。調製した試薬は室温で数ヶ月保存可能。
プロトコル
- タンパク質溶液サンプル（100 μL）にBiuret試薬を1mL加えてボルテックス攪拌する。
- 室温で20-30分以上静置する
- 540 nmの吸光度を測定する
- BSAを標準試料として希釈系列と検量線を作成し、それをもとに濃度を定量する。
関連動画
参考文献
- ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
- “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Met. Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
- “A New Colorimetric Assay of Tabletop Sweeteners Using a Modified Biuret Reagent” Fenk, C. J.; Kaufman, N.; Gerbig, D. G. Jr. J. Chem. Educ. 2007, 84, 1676. doi:10.1021/ed084p1676
関連書籍
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (3-Volume Set)
Green, Michael R., Sambrook, Joseph
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外部リンク
- ”総”タンパク質定量法の種類をまとめてみた（Thermo Fisher）
- タンパク質を定量したい（同仁化学、PDF）
- 分光光度計を利用したタンパク質の定量（Cytiva）
- タンパク質の定量法（生命医学をハックする）
- タンパク質の定量
- ビウレット反応 – Wikipedia
- Biuret test – Wikipedia
