分取薄層クロマトグラフィー PTLC (Preparative Thin-Layer Chromatography)

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分取薄層クロマトグラフィー PTLC (Preparative Thin-Layer Chromatography)

2018/9/6
chemglossary, 化学者のつぶやき, 実験・テクニック, 有機化学
Preparative Thin-Layer Chromatography, PTLC, カラム, カラムクロマトグラフィー, プレパラ, 精製
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投稿者: Gakushi

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最近マスターの学生に分取薄層クロマトグラフィー (Preparative Thin-Layer Chromatography)　PTLCの仕方を教える機会があったので、~~何度も同じ事を毎年教えるのが面倒臭いので~~今回はその手法について書いてみたいと思います。研究室によって流儀はかなり違うようようなので、ここでは私が使ってきた方法を紹介します。もっと簡便な方法をご存知であればコメント頂けると幸いです。

特徴

PTLCは通常のTLCより厚いPTLCで展開したスポットをシリカゲルごと掻き取って、溶媒抽出する精製法です。以下に欠点と利点をまとめました。

欠点

シリカゲル上での分解やシリカゲルの回収不足により収率が低下する場合がある。
シリカゲル上で不安定な化合物の精製に向かない（二次元TLCで要確認）。
得られる量が限られ、スケールアップに適さない。
UV吸収のある官能基を持たない化合物の精製は可能ではあるが適さない。

利点

簡便である。
適切な溶媒を用いれば確実にきれいに精製できる。
時にはカラムクロマトグラフィーに比べてシリカゲルの粒度などの問題から分離が良い場合がある。
一回のカラムクロマトグラフィーで分けられない場合、PTLCの方が早いことがある。

準備するもの

清潔な実験机（汚いとコンタミします。安全上の観点からも机はきれいにしておきましょう。）、PTLC　例えば、0.5 mm、10 x 20 cmまたは20 x 20 cm、チャージに用いる極性溶媒、先をとがらせたパスツールピペット、展開溶媒　(50 mL程度)、TLC展開槽、抽出溶媒、古いカッター、掻き取り用スパチュラ、グラスフィルターもしくはパスツールピペットなど。

展開槽の準備とサンプル調整

TLCでRf値0.4ー0.5程度となる混合溶媒を50 mL程度用意し展開層に入れ（溶媒量は展開槽に1 cmもあれば充分。あまりにも多すぎると原点に漬かってしまうので注意。）、展開層を溶媒蒸気で満たす。展開槽に濾紙を入れておくと展開が速くなる。

サンプルはできるだけ小さいフラスコで濃縮し、最小量の溶媒で溶かす。（一枚のプレートに載せるために約0.4 mLの溶媒に溶かし、アプライ時に二回程度プレートを反復できる量が最適かと思います。）

PTLCの選択

PTLCは主にMerck Milliporeから市販されている、0.5 mm、1.0 mm、2.0 mmのものが汎用されます。購入時には蛍光剤入りかそうでないか用途に合わせて選択してください。もちろんPTLCは結構お高いですので、F254 インディケーター入りのシリカゲルとガラス板を用いてPTLCを自作することもできます。さらに良い分離を求める場合、粒度の整ったシリカゲルベースのHPTLC (High Perfromance Thin-Layer Chromatography) も市販されているので試してみても良いかもしれません。（実際にはHPTLCはPTLCに比べてさらに高価だし、厚さは0.2 mmなので量的な供給の意味でもあまり現実的では無いので、PTLCでうまく別れなかった場合は逆層HPLC、順層HPLCで分離するのがセオリーかと思われます。最悪、Chiralカラムを使うと逆相カラムよりも優れた分離が可能である倍もあるので、利用できるかもしれません。）そのほか、ある程度量が必要で良い分離を求めたい場合はBiotageのSNAP Ultraカラムなど、粒度の揃ったカラムで分けるという方法もあるので、どの方法を利用するかは実験室の設備、と分離次第かと思われます。

TLCの厚さ及び枚数の選択します。Merck Milliporeのwebsiteによると、0.5 mmのものならば50 mgチャージできるらしいですが、実際にはそれだけ載せると絶対に別れないので、シビアな分離には載せる化合物の量を減らすべきです。載せてもせいぜい0.5 mmで20 mg、1.0 mmで40 mg程度、通常は0.5 mmで10 mg以下、1.0 mmで20 mg以下です。私の所属していた研究室では、展開が早く、分離も良いので0.5 mmのPTLCを半分に切り使っていました。

実際の実施例を下に示します。［0.5 mm PTLC (10 x 20 cm半分のサイズ) に5 mgのサンプルをチャージして展開した場合。この際展開の高さは10 cm。この実施例の場合かなり厳しい分離なので、量を減らし低極性混合溶媒で二度展開している。］

サンプルのチャージ

初めてプレパラを行う場合は、5 mm程度の高さに水平に鉛筆で線を引き、そこにめがけてサンプルを載せるとやりやすい。（慣れたら面倒くさいのでしない。）

両サイド5 mm空け、先の細いパスツールを使ってサンプル溶液を均一にPTLCに載せる。この際、手早くしないとぼたっとこぼしてしまうことがあるので（エーテルなどの低沸点溶媒を用いると蒸気圧の関係でサンプル溶液を落としやすい）、初めて行う場合は溶媒で何回か練習するとよい。場合によっては少々沸点の高いクロロホルムなどをサンプル溶液の調整に用いると乾くのに時間がかかるものの、より確実にプレートに乗せることができる。

チャージのための方法としては１、やや太めのガラスキャピラリーの毛細管現象を利用し、HPLCバイアルなどに濃縮したサンプルをアプライする方法、２、ライターであぶって先をとんがらせたパスツールピペットから直接アプライする方法、３、マメにパスツールピペットでつつく方法、４、パスツールに綿を詰め、毛細管現象を利用してアプライする方法（恐らくこれが一番主流?）、5、シリンジとニードルによりアプライする方法（ヨーロッパではコレが主流?）、など様々あるが、結局のところ均一にアプライさえできればよいので気に入ったものを使えばよい。

PTLCを乾かす。その後、別の展開槽にエーテルや酢酸エチルなどの極性溶媒を張り、溶媒前線を揃える。（もちろんアプライが一発で綺麗にうまくいけば必要ない。）しっかりと極性溶媒を乾かし、展開の準備を行う。

展開および掻き取り

溶媒蒸気で満たした展開槽の中に置いて展開する。溶媒前線が上がりきるまで待ち、到達したらバンドの分散を防ぐためすぐに展開槽から出し、乾燥させる。所要時間は溶媒により異なる。

ハロゲン系溶媒で20 cm上げる場合、溶媒の蒸発により溶媒前線が20 cmに届かない場合があるのであまり上げすぎない。さらによい分離を望む場合、Rf値の小さい展開溶媒を作成し、多重展開（展開終了後、乾燥、もう一度展開する。）するとよい結果が得られることがある。（変法として、10 cm程度上がったところで、乾燥、目的の化合物よりRfが小さい不必要な部分をTLCカッターで切り取り、さらに多重展開するといった方法もある。）

乾燥後UVでバンドの位置を確認し、鉛筆でバンドをマークする。UV吸収のない化合物の場合はPTLCの中心部を1 cm切り取り、適当な発色剤を用いて染色により目的化合物の場所を確認することができる。（UVの無い化合物でも濃度が高いとUVで見たときに薄くバンドが見えることがあるので参考にするとよい場合もある。）

目的のバンドをカッター、カミソリ、スパチュラなどを用いて掻き取る。掻き取ったシリカゲルは清潔なA4の紙または秤量紙に移す。ここで掻き取ったシリカゲルが風で飛ばないように注意する。（間違ってもドラフトを閉めた時に、、、あああああ！っとならない様に注意しましょう。）必要に応じてここでシリカゲルを粉砕し、掻き取ったシリカゲルの量に応じてフィルターなどにシリカゲルが舞わないように載せる。

生成物と思われるバンドは吸着分子の分解が起こりやすくなるため、できるだけ速やかに全て掻き取る必要がある。化合物のシリカゲル上での安定性に不安がある場合、PTLCを行う前に、二次元TLCを行い安定性を確認すべきである。

ろ過

グラスフィルターでの吸引ろ過する。この場合、あらかじめシリカゲルを粉砕する必要はなく、溶媒をゆっくりと注いだ段階でシリンジもしくはバイアルの腹でシリカゲルを潰せばシリカゲルを粉砕可能。

シリカゲルの量が少ない場合（例えば、0.5 mmプレート一枚程度でPTLCを行なった場合）はシリカゲルを粉砕後、抽出溶液に懸濁させ（場合によっては、極性溶媒に懸濁し、極性溶媒中でシリカゲルを超音波処理する方法もある。）、パスツールピペットに多めに綿を固く詰め、パスツールカラムの要領でろ過する。（懸濁液を移す際はパスツールピペットの先が太くなる様に途中で折ってから手早く、比較的たくさんの綿あらかじめ詰めたパスツールに載せるとシリカゲルで目詰まりしない。（本方法はろ過後パスツールを使い捨てにできる）化合物の極性にもよるが、シリカゲルの厚さの3回分程度抽出溶媒を通せばほぼ確実にすべての化合物を集められる。

きれいなグラスフィルターが無かったり、シリカゲルの量が多い場合は、カラム管を用いるなどすればよい。カラム管を使う場合PTLCのシリカゲルは通常のカラム用の230-400 meshのものに比べて粒度が細かいので、できるだけシリカゲル層がうすくなるようにするのがポイント。海砂をカラム管に予め入れておき、その上から掻き取ったシリカゲルを載せればまずシリカゲルがコンタミすることはない。

抽出溶媒としては化合物が溶け、高いRf値をとなる極性溶媒（エーテル、酢酸エチル、３０％メタノール）が用いられる。抽出溶媒としてメタノールを使用する場合、微量の炭酸カルシウム等無機物質が溶出する可能性があるので（リンクはこちら）、３０％を超えないようにする等工夫が必要。また、PTLCには通常過剰量の溶出溶媒を用いるため、溶出に用いる溶媒純度は高いものを使うべきである。

溶出した溶液を濃縮して終了。