[スポンサーリンク]

化学者のつぶやき

細胞表面受容体の機能解析の新手法

[スポンサーリンク]

 

細胞表面の受容体の機能解析には、GFPなどの蛍光タンパク質を目的の受容体へ結合させて可視化する方法がよく用いられます。しかしこの方法は遺伝子組み換えを伴うため内在性の受容体には適していません。内在性受容体の解析の場合は、蛍光標識した抗体を用いて受容体を標識する抗体染色が一般的な手法として広く用いられています。

一方で、この方法は抗体を介するため、

  1. 受容体を直接ラベル化することができない
  2. ラベル化が可逆的である

と攻略しなければならない大きな2つの課題があります。

最近、海賊王、京都大学の浜地らは、独自に開発してきたAffinity-Guided DMAP化学(AGD化学)を抗体と組みあわせることで、これらの課題を解決しうる新しいラベル化法を開発しましたので簡単に紹介したいと思います(図は下記論文から出典)。

 

“Analysis of Cell-Surface Receptor Dynamics through Covalent Labeling by Catalyst-Tethered Antibody”

Hayashi, T.; Yasueda, Y.; Tamura, T.; Takaoka, Y.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc.2015, 137, 5372. DOI: 10.1021/jacs.5b02867

 

AGD化学とは

浜地らが開発した、リガンドにDMAPを連結したリガンド連結DMAPを触媒として、チオエステル誘導体をアシルドナーとして用い、標的タンパク質をラベル化する方法です(図1)[1]。生物はちょっとと思う方も、よく見れば大学初年度の有機化学で習う有機反応をタンパク質でやっていることがわかるでしょう。ラベル化はアミド結合を活性本体とは離れたところで形成するため、不可逆的かつ、タンパク質の活性を変えないという利点があります。ここで、ラベル化剤に蛍光分子を用いれば標的タンパク質を可視化することができます。これまでのAGD化学をつかって、標的タンパク質を認識するリガンドとしてFK506、ペプチド、糖鎖などをラベル化することに成功しています。[2][3]

Affinity-Guided DMAP化学

Affinity-Guided DMAP化学

(a)リガンドによるタンパク質の認識 (b)DMAPによるアシルドナーの活性化(c)タンパク質のアミノ酸上の置換基による求核攻撃 (d)リガンドの脱離

 

DMAP連結抗体をつくる

今回はリガンドとして、抗体を用います。筆者らは、リンカーの長さが異なるDMAP連結anti-HER2 scFvを3種類とDMAP連結anti-EGFR affibodyを2種類合成しました(図2)。続いてHER2タンパク質を発現させた培養細胞をDMAP連結抗体とアシルドナー(4)で処理すると、HER2を選択的に蛍光標識できました。このラベル化の効率は、リンカーの長さと温度に依存します。ここはさらっと書いていますが、泥臭い条件検討が必要な部分ですね。

*EGFR: human epidermal growth factor receptor, HER2: epidermal growth factor receptor 2

*scFv(single chain Fv):抗体が抗原を認識する最小部位をペプチドリンカーでつないだもの。標的タンパク質を特異的に認識するためのプローブ。

 

2015-05-15_23-34-09

図2. 各種DMAP連結抗体、アシルドナー、HER2へのラベル化の結果

 

内在性の受容体への蛍光標識と動態解析

では内在性の受容体ではどうか。

内在性HER2、EGFRそれぞれに対して、DMAP連結抗体とアシルドナー(4)で処理すると、内在性HER2、EGFRをそれぞれ選択的に蛍光標識することに成功しました (図3. a, b)。

続いて、ラベル化が可逆的な抗体染色では困難な動態解析に取り組みました。EGFRはEGFの添加により細胞内に輸送されることが知られています。[4]DMAP連結抗体によりEGFRを蛍光ラベルした後、EGFを加え3時間放置したところ、EGFRを細胞内部で観測することに成功しました (図3. c)。

さらに、HER2 をDMAP連結抗体によりFL (Fluorescein)でラベル化し、FLでラベル化されたHER2を数時間ごとにウエスタンブロッティングで定量しました。その結果、HER2の総量は一定であったがFLでラベル化されたHER2の量は減少するため、HER2の分解と生合成が常に繰り返されていることが明らかになりました(図3. d)。

一方で、GA (geldanamycin)の添加によりHER2の分解が促進されることが知られています[5]。DMAP連結抗体でラベル化したのちGAを加え、ラベル化されたHER2を数時間ごとにウエスタンブロティングで定量しました。FLでラベル化されたHER2の分解速度が、GAを添加しない場合と比較し加速していることが観測されました。さらに、HER2の総量も減少しました。この結果は、GAの添加により、HER2の分解速度が生合成速度を上回った、もしくは、HER2の生合成が阻害されたことを示唆しています(図3. e)。

 

図3. 内性の受容体への選択的ラベル化

図3. 内性の受容体への選択的ラベル化

 

HER2のラベル化された位置の解析 (図 4)

ペプチドマスフィンガープリンティングによりHER2のラベル化されたアミノ酸残基を特定したところ、リンカーの長さから想定されるラベル化領域外に、ラベル化されたアミノ酸残基が存在しました(図4)。このことからHER2が揺らいでいるという、結晶構造解析では分かり得ない、より自然に近いHER2の挙動を観測することができています。

 

2015-05-15_02-29-24

図4. HER2の結晶構造

 

最後に

今回の報告では、既存の抗体染色による問題点を克服した新たなラベル化法を開発しました。また 同時に抗体 を用いることで、AGD化学の汎用性が飛躍的に向上しています。今後は、細胞表面の受容体の動態や分子間相互作用を解明する手法としてDMAP連結抗体が活躍することを期待したいと思います。

 

参考・関連文献

  1. AGD化学/浜地研究室
  2. Koshi, Y.; Nakata, E.; Miyagawa, M.; Tsukiji, S.; Ogawa, T.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 245. DOI: 10.1021/ja075684q
  3. Hayashi, T.; Sun, Y.; Tamura, T.; Kuwata, K.; Song, Z.; Takaoka, Y.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 12252. DOI: 10.1021/ja4043214

 

関連書籍

bona

投稿者の記事一覧

愛知で化学を教えています。よろしくお願いします。

関連記事

  1. 研究者のためのCG作成術④(レンダリング編)
  2. 窒素を挿入してペリレンビスイミドを曲げる〜曲面π共役分子の新設計…
  3. 学振申請書を磨き上げるポイント ~自己評価欄 編(後編)~
  4. Reaxys体験レポート:ログイン~物質検索編
  5. 高専シンポジウム in KOBE に参加しました –その 2: …
  6. SciFinder Future Leaders 2017: プ…
  7. ChemDrawの使い方【作図編②:触媒サイクル】
  8. 青色LEDで駆動する銅触媒クロスカップリング反応

コメント、感想はこちらへ

注目情報

ピックアップ記事

  1. ボールマン・ラーツ ピリジン合成 Bohlmann-Rahtz Pyridine Synthesis
  2. 2009年度日本学士院賞、化学では竜田教授が受賞
  3. PACIFICHEM2010に参加してきました!④
  4. 「サンゴ礁に有害」な日焼け止め禁止法を施行、パラオ
  5. 構造式を楽に描くコツ!? テクニック紹介
  6. 多孔性材料の動的核偏極化【生体分子の高感度MRI観測への一歩】
  7. 112番元素が正式に周期表の仲間入り
  8. 橋頭位二重結合を有するケイ素化合物の合成と性質解明
  9. 有機合成化学協会誌2021年7月号:PoxIm・トリアルキルシリル基・金触媒・アンフィジノール3・効率的クリック標識法・標的タンパク質指向型天然物単離
  10. アザジラクチンの全合成

関連商品

ケムステYoutube

ケムステSlack

月別アーカイブ

2015年5月
 123
45678910
11121314151617
18192021222324
25262728293031

注目情報

注目情報

最新記事

Ni(0)/SPoxIm錯体を利用した室温におけるCOの可逆的化学吸着反応

第395回のスポットライトリサーチは、大阪大学大学院 工学研究科 (生越研究室)・山内泰宏さんにお願…

第27回ケムステVシンポ『有機光反応の化学』を開催します!

7月に入り、いよいよ日差しが強まって夏本格化という時期になりました。光のエネルギーを肌で感じられます…

国内最大級の研究者向けDeepTech Company Creation Program「BRAVE FRONTIER」 2022年度の受付開始 (7/15 〆切)

Beyond Next Ventures株式会社(本社:東京都中央区、代表取締役社⻑:伊藤毅、以下「…

イミンアニオン型Smiles転位によるオルトヒドロキシフェニルケチミン合成法の開発

第394回のスポットライトリサーチは、東京農工大学 大学院工学府 応用化学専攻 森研究室の神野 峻輝…

マテリアルズ・インフォマティクスで用いられる統計[超入門]-研究者が0から始めるデータの見方・考え方-

開催日:2022/07/06 申込みはこちら■開催概要近年、少子高齢化、働き手の不足の影…

表面酸化した銅ナノ粒子による低温焼結に成功~銀が主流のプリンテッドエレクトロニクスに、銅という選択肢を提示~

第393回のスポットライトリサーチは、北海道大学 大学院工学院 材料科学専攻 マテリアル設計講座 先…

高分子材料におけるマテリアルズ・インフォマティクスの活用とは?

 申込みはこちら■セミナー概要本動画は、20022年5月18日に開催されたセミナー「高分…

元素のふるさと図鑑

2022年も折り返しに差し掛かりました。2022年は皆さんにとってどんな年になり…

Q&A型ウェビナー カーボンニュートラル実現のためのマイクロ波プロセス 〜ケミカルリサイクル・乾燥・濃縮・焼成・剥離〜

<内容>本ウェビナーでは脱炭素化を実現するための手段として、マイクロ波プロセスをご紹介いたします…

カルボン酸、窒素をトスしてアミノ酸へ

カルボン酸誘導体の不斉アミノ化によりキラルα-アミノ酸の合成法が報告された。カルボン酸をヒドロキシル…

Chem-Station Twitter

実験器具・用品を試してみたシリーズ

スポットライトリサーチムービー

PAGE TOP