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化学者のつぶやき

タンパク質の定量法―ビシンコニン酸法 Protein Quantification – Bicinconic Acid Assay

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原理

ビシンコニン酸(BCA)法(Bicinconic Acid  Assary)はLowry法をさらに改良した比色法であり、タンパク質濃度定量に用いられる。

Lowry法におけるFolin試薬のかわりにビシンコニン酸 (BCA)を添加する。Cu2+がタンパク質によって還元されて生じるCu+がBCAと複合体を形成して赤紫色に発色する。この562nmの吸光度を測定し、検量線を用いることによって定量する。

長所

  • 測定範囲は0.001-2 mg/mL、感度が高い
  • 広い範囲で直線性を示す
  • 操作が簡便
  • Lowry法よりも界面活性剤の影響を受けにくい

短所

  • キレート剤やチオール還元剤などで妨害される

プロトコル

BCAアッセイキットは各社から市販されているが、下記のレシピにて試薬は調製可能である。

BCA試薬の調製法

A液
ビシンコニン酸ナトリウム(10 g)、Na2CO3(20 g)、酒石酸ナトリウム(1.6 g)、NaOH(4 g)、NaHCO3(9.5 g)をMQ水に溶解し、1 Lにメスアップする。その後、10N NaOH水溶液によってpHを11.25に合わせる。室温にて数ヶ月保存可能。

B液
Cu2SO4-5H2O(4 g)MQ水に溶解し、全量100 mLとする。室温にて数ヶ月保存可能。

プロトコル
  1. 50容量のA液と、1容量のB液を混合する(用時調製)
  2. サンプル(100 μL)に対し、1.の混合液を1mL加え、ボルテックス攪拌する
  3. 37℃で30分静置する
  4. 562 nmの吸光度を測定する。
  5. BSAを標準試料として希釈系列と検量線を作成し、それをもとに濃度を定量する。

関連動画

 

参考文献

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Met. Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
  3. “Measurement of protein using bicinchoninic acid” Smith, P. K. et al. Anal. Biochem. 1985, 150, 76. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

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博士(薬学)。Chem-Station副代表。国立大学教員→国研研究員にクラスチェンジ。専門は有機合成化学、触媒化学、医薬化学、ペプチド/タンパク質化学。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

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