原理
ビシンコニン酸（BCA）法（Bicinconic Acid Assary）はLowry法をさらに改良した比色法であり、タンパク質濃度定量に用いられる。
Lowry法におけるFolin試薬のかわりにビシンコニン酸 (BCA)を添加する。Cu2+がタンパク質によって還元されて生じるCu+がBCAと複合体を形成して赤紫色に発色する。この562nmの吸光度を測定し、検量線を用いることによって定量する。
長所
- 測定範囲は0.001-2 mg/mL、感度が高い
- 広い範囲で直線性を示す
- 操作が簡便
- Lowry法よりも界面活性剤の影響を受けにくい
短所
- キレート剤やチオール還元剤などで妨害される
プロトコル
BCAアッセイキットは各社から市販されているが、下記のレシピにて試薬は調製可能である。
BCA試薬の調製法
A液
ビシンコニン酸ナトリウム（10 g）、Na2CO3（20 g）、酒石酸ナトリウム（1.6 g）、NaOH（4 g）、NaHCO3（9.5 g）をMQ水に溶解し、1 Lにメスアップする。その後、10N NaOH水溶液によってpHを11.25に合わせる。室温にて数ヶ月保存可能。
B液
Cu2SO4-5H2O（4 g）MQ水に溶解し、全量100 mLとする。室温にて数ヶ月保存可能。
プロトコル
- 50容量のA液と、1容量のB液を混合する（用時調製）
- サンプル（100 μL）に対し、1.の混合液を1mL加え、ボルテックス攪拌する
- 37℃で30分静置する
- 562 nmの吸光度を測定する。
- BSAを標準試料として希釈系列と検量線を作成し、それをもとに濃度を定量する。
関連動画
参考文献
- ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
- “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Met. Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
- “Measurement of protein using bicinchoninic acid” Smith, P. K. et al. Anal. Biochem. 1985, 150, 76. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
関連書籍
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (3-Volume Set)
Green, Michael R., Sambrook, Joseph
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外部リンク
- ”総”タンパク質定量法の種類をまとめてみた（Thermo Fisher）
- タンパク質を定量したい（同仁化学、PDF）
- 分光光度計を利用したタンパク質の定量（Cytiva）
- タンパク質の定量法（生命医学をハックする）
- タンパク質の定量
- Bicinconic acid assay – Wikipedia
- ビシンコニン酸 – Wikipedia
- タンパク質定量（BCA法）（PDF）
