原理
ブラッドフォード法（Bradford Protein Assary）は BCA法と並び、もっともよく使われるタンパク質の濃度定量法である。
クマシーブリリアントブルー（CBB） G-250という色素がタンパク質の塩基性・芳香族アミノ酸側鎖と相互作用する結果、その吸収ピークが465 nm→595 nmへと変化すること（メタクロマジー）を応用している。
長所
- 測定範囲は0.01-2 mg/mL、感度が高い
- 操作がきわめて簡単、迅速
- キレート剤・還元剤の影響を受けにくい
短所
- 界面活性剤の影響は受けやすい
- 反応液が酸性であるため、脂質を含むサンプルは沈殿を生じやすい
- タンパク質種によって結果が変動する
- 色素がガラスや石英のキュベットに吸着する
プロトコル
Bradfordアッセイキットは各社から市販されているが、下記のレシピにて試薬は調製可能である。
Bradford試薬の調製法
CBB G-250 (200 mg)をエタノール（100 mL）中に攪拌して良く溶かす。その後85%リン酸（200 mL）を加える。これをMQ水へと加えて、2 Lにする。この溶液に含まれる青色不溶成分を、脱脂綿や＃1ろ紙でろ過して除く。冷蔵庫で遮光保存する。
プロトコル
- サンプル（100 μL）に対し、Bradford試薬を1mL加え、ボルテックス攪拌する
- 5～30分の間に595 nmの吸光を測定する。
- BSAを標準試料として希釈系列と検量線を作成し、それをもとに濃度を定量する。
膜タンパク質などの場合、可溶化するために1M NaOH水溶液の添加が推奨されている[2]。
関連動画
参考文献
- ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
- “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Met. Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
- “Comparison of five methods for determination fo total plasma protein concentration” Okutucu, B.; Dincer, A.; Habib, Ö.; Zihnioglu, F. J. Biochem. Biophys. Methods 2007, 70, 709. doi:10.1016/j.jbbm.2007.05.009
- “A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding” Bradford, M. M. Anal. Biochem. 1976, 72 (1–2), 248–254. doi:10.1006/abio.1976.9999
- ”Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies” Zor, T.; Selinger, Z. Anal Biochem. 1996, 236, 302. doi:10.1006/abio.1996.0171
関連書籍
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (3-Volume Set)
Green, Michael R., Sambrook, Joseph
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外部リンク
- ”総”タンパク質定量法の種類をまとめてみた（Thermo Fisher）
- タンパク質を定量したい（同仁化学、PDF）
- 分光光度計を利用したタンパク質の定量（Cytiva）
- タンパク質の定量法（生命医学をハックする）
- タンパク質の定量
- Bradford protein assay – Wikipedia
- クマシーブリリアントブルー – Wikipedia
- ブラッドフォード試薬の原理・作り方・プロトコル
