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化学者のつぶやき

タンパク質の定量法―紫外吸光法 Protein Quantification – UV Absorption

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原理

タンパク質中には紫外光を吸収するアミノ酸残基が含まれる。特にチロシン・トリプトファンの側鎖に由来する吸収が280 nm付近に存在する。バッファーにはこの付近に吸収をもつものが少ないため、この吸光度(A280)を計測することで、Lambert-Beerの法則に基づく濃度定量が行える。A280 = 1.0 (l =1 cm)のとき、タンパク質濃度が概ね1 mg/mLであるとして計算する。

実際にはタンパク質毎にチロシン・トリプトファン含有量が異なるので、この方法は厳密ではないが、簡便かつすぐに測定でき、サンプルを回収出来る点で価値が高い。

長所

  • サンプルの回収・再利用が可能
  • 操作が簡単で迅速

短所

  • 測定範囲は0.05-2 mg/mL、感度は比較的低い
  • 芳香族アミノ酸を持たないタンパク質(コラーゲンなど)は定量できない
  • タンパク質によって吸光度が異なる
  • 紫外吸収を持つ物質の混入は測定を妨害する[2]

(画像はこちらより引用)

 

測定上の注意点・コツ

  • とくにヌクレオチド類は260~280 nmに吸収をもつので注意が必要となる。A280/A260<1.5になると核酸の混入が疑われるため、他の方法を検討する。少量であれば下記補正式で濃度算出が可能である[3]

タンパク質濃度 [mg/mL] = 1.55 x A280 – 0.76 x A260

(画像はこちらから引用)

  • 紫外吸収測定用のサンプルセルは石英製を使う。プラスチック・ガラスは適さない。
  • Nanodropと呼ばれる装置をもちいることで、1-2μL程度の液量で測定可能。
  • 280 nmにおけるモル吸光係数(ε280)は、トリプトファン・チロシン・システイン二量体(シスチン)の含有量から、下記の式で計算可能である[4]こちらのサイトに一次配列を打ち込むことでも計算できる。

    ϵ280 [M-1cm-1]= nW x 5,500 + nY x 1,490 + nC x 125 (C = cystine)

関連動画

参考文献

  1. ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
  2. “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Methods Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
  3. ”Isolation and Crystallization of Enolase” Warburg, O.; Christian W. Biochem. Z. 1942, 310, 384.
  4. “How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein” Pace, C. N.; Vajdos, F.; Fee, L.; Grimsley, G.; Gray, T. Protein Sci. 1995, 4, 2411. doi:10.1002/pro.5560041120

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博士(薬学)。Chem-Station副代表。国立大学教員→国研研究員にクラスチェンジ。専門は有機合成化学、触媒化学、医薬化学、ペプチド/タンパク質化学。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

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