タンパク質の定量法―紫外吸光法 Protein Quantification – UV Absorption

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化学者のつぶやき

タンパク質の定量法―紫外吸光法 Protein Quantification – UV Absorption

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原理

タンパク質中には紫外光を吸収するアミノ酸残基が含まれる。特にチロシン・トリプトファンの側鎖に由来する吸収が280 nm付近に存在する。バッファーにはこの付近に吸収をもつものが少ないため、この吸光度（A₂₈₀）を計測することで、Lambert-Beerの法則に基づく濃度定量が行える。A₂₈₀ = 1.0 (l ＝1 cm)のとき、タンパク質濃度が概ね1 mg/mLであるとして計算する。

実際にはタンパク質毎にチロシン･トリプトファン含有量が異なるので、この方法は厳密ではないが、簡便かつすぐに測定でき、サンプルを回収出来る点で価値が高い。

長所

サンプルの回収・再利用が可能
操作が簡単で迅速

短所

測定範囲は0.05-2 mg/mL、感度は比較的低い
芳香族アミノ酸を持たないタンパク質（コラーゲンなど）は定量できない
タンパク質によって吸光度が異なる
紫外吸収を持つ物質の混入は測定を妨害する^[2]

（画像はこちらより引用）

測定上の注意点・コツ

とくにヌクレオチド類は260～280 nmに吸収をもつので注意が必要となる。A₂₈₀/A₂₆₀＜1.5になると核酸の混入が疑われるため、他の方法を検討する。少量であれば下記補正式で濃度算出が可能である^[3]。

タンパク質濃度 [mg/mL] = 1.55 x A₂₈₀ – 0.76 x A₂₆₀

(画像はこちらから引用)

紫外吸収測定用のサンプルセルは石英製を使う。プラスチック・ガラスは適さない。
Nanodropと呼ばれる装置をもちいることで、1-2μL程度の液量で測定可能。
280 nmにおけるモル吸光係数（ε₂₈₀）は、トリプトファン・チロシン・システイン二量体（シスチン）の含有量から、下記の式で計算可能である^[4]。こちらのサイトに一次配列を打ち込むことでも計算できる。
ϵ₂₈₀ [M^-1cm^-1]= nW x 5,500 + nY x 1,490 + nC x 125 （C = cystine）

参考文献

”総タンパク質の定量法”　鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
“[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Methods Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
”Isolation and Crystallization of Enolase” Warburg, O.; Christian W. Biochem. Z. 1942, 310, 384.
“How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein” Pace, C. N.; Vajdos, F.; Fee, L.; Grimsley, G.; Gray, T. Protein Sci. 1995, 4, 2411. doi:10.1002/pro.5560041120

博士(薬学)。Chem-Station副代表。国立大学教員→国研研究員にクラスチェンジ。専門は有機合成化学、触媒化学、医薬化学、ペプチド/タンパク質化学。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。