原理
タンパク質中には紫外光を吸収するアミノ酸残基が含まれる。特にチロシン・トリプトファンの側鎖に由来する吸収が280 nm付近に存在する。バッファーにはこの付近に吸収をもつものが少ないため、この吸光度（A280）を計測することで、Lambert-Beerの法則に基づく濃度定量が行える。A280 = 1.0 (l ＝1 cm)のとき、タンパク質濃度が概ね1 mg/mLであるとして計算する。
実際にはタンパク質毎にチロシン･トリプトファン含有量が異なるので、この方法は厳密ではないが、簡便かつすぐに測定でき、サンプルを回収出来る点で価値が高い。
長所
- サンプルの回収・再利用が可能
- 操作が簡単で迅速
短所
- 測定範囲は0.05-2 mg/mL、感度は比較的低い
- 芳香族アミノ酸を持たないタンパク質（コラーゲンなど）は定量できない
- タンパク質によって吸光度が異なる
- 紫外吸収を持つ物質の混入は測定を妨害する[2]
（画像はこちらより引用）
測定上の注意点・コツ
- とくにヌクレオチド類は260～280 nmに吸収をもつので注意が必要となる。A280/A260＜1.5になると核酸の混入が疑われるため、他の方法を検討する。少量であれば下記補正式で濃度算出が可能である[3]。
タンパク質濃度 [mg/mL] = 1.55 x A280 – 0.76 x A260
(画像はこちらから引用)
- 紫外吸収測定用のサンプルセルは石英製を使う。プラスチック・ガラスは適さない。
- Nanodropと呼ばれる装置をもちいることで、1-2μL程度の液量で測定可能。
- 280 nmにおけるモル吸光係数（ε280）は、トリプトファン・チロシン・システイン二量体（シスチン）の含有量から、下記の式で計算可能である[4]。こちらのサイトに一次配列を打ち込むことでも計算できる。
ϵ280 [M-1cm-1]= nW x 5,500 + nY x 1,490 + nC x 125 （C = cystine）
関連動画
参考文献
- ”総タンパク質の定量法” 鈴木祥夫、ぶんせき 2018, 1, 2. [PDF]
- “[6] Quantification of protein” Stoscheck, C. M. Methods Enzymol. 1990, 182, 50. doi:10.1016/0076-6879(90)82008-P
- ”Isolation and Crystallization of Enolase” Warburg, O.; Christian W. Biochem. Z. 1942, 310, 384.
- “How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein” Pace, C. N.; Vajdos, F.; Fee, L.; Grimsley, G.; Gray, T. Protein Sci. 1995, 4, 2411. doi:10.1002/pro.5560041120
関連書籍
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (3-Volume Set)
Green, Michael R., Sambrook, Joseph
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外部リンク
- ”総”タンパク質定量法の種類をまとめてみた（Thermo Fisher）
- タンパク質を定量したい（同仁化学、PDF）
- 分光光度計を利用したタンパク質の定量（Cytiva）
- 生化夜話 第52回：核酸の純度を示すA260/A280、はじめて使ったのは誰？(Cytiva)
- タンパク質の定量法（生命医学をハックする）
- タンパク質の定量
