創薬研究やバイオプローブの開発において、しばしば問題になるのが分子の膜透過性。特にオリゴヌクレオチドやタンパク質などの大きな分子は膜透過効率が低く、医薬応用の大きな障害となります。今回は分子の性質をうまくつかって、その障害の解決に取り組んでいる一例を紹介したいと思います。

細胞膜のなかに入りたい

膜透過効率を上げる手法として、「膜透過性ペプチド」(Cell-Penetrating Peptide：CPP)を利用する方法があります。CPPはアルギニンを多く含んだ塩基性のペプチドで、細胞膜を能動的に透過することが知られているからです。従って、取り込ませたいタンパク質やペプチドなどにCPPを結合させると、効率的に細胞内へ導入することができます。

しかし、CPPは細胞毒性を持つ、必ず機能するとは限らない（当たり前ですが）などの問題があります。

そこでCPPによらない、新しい膜透過機構として、膜透過性ポリジスルフィド(Cell-Penetrating poly(disulfide)s: CPDs)が開発されています。CPDは図 1に示したように、細胞表面のチオール基とジスルフィド交換反応を起こし、細胞表面に固定化されます。このときCPDに細胞内へ導入したい基質をつけておけば、基質はエンドサイトーシスなどを経て、細胞内に取り込まれます。^[1]

図1 Schematic illustration of a cellular uptake via S-S exchange.

さて、ジェノバ大学のMatileらは近年、このCPDsの応用としてsiCPDs(substrate-initiated, self-inactivating CPDs)を報告しました（Figure 2）。^[2] これは、細胞内に導入したい分子をポリマー開始剤として用い、細胞膜透過に有利となるグアニジンを有するモノマーなどと重合することでポリジスルフィド化合物を合成し、膜透過させるものです。

図2 Concept of substrate-initiated, self-inactivating CPD transporters.

環歪みを細胞取り込みに活かす

さらに最近Matileらは、高い反応性をもつ環状ジスルフィドが、ポリマー化しなくても、膜表面への固定化され、膜透過することを報告しました。

“Ring Tension Applied to Thiol-Mediated Cellular Uptake”

Gasparini, G.; Sargsyan, G.; Bang, E. K.; Sakai, N.; Matile, S. Angew. Chem, Int. Ed. 2015, 7328. DOI: 10.1002/anie.201502358

発光団としてカルボキシルフルオレセインを導入した化合物3–7をHeLa Kyoto細胞に添加し、フローサイトメトリーによってこれらの細胞の蛍光強度を測定しました(図 3)。ここから、最大の環歪みを持つ化合物3で蛍光強度が最大であり、環歪みの小さな化合物4,5、直鎖で環歪みを持たない化合物6,7の順に蛍光強度が小さくなることがわかりました。この結果は、細胞膜上でのジスルフィド交換反応がCSSC結合の二面角が小さいほど、すなわち反応性の高いジスルフィドほど、有利に反応が進行することを示唆しています。さらに論文中ではあらかじめ膜表面のチオール基を活性化または不活性化させた後に活性評価実験をおこなうことで、膜表面への固定化のメカニズムを検証しています。

図3 Flow cytometry data showing the fluorescence of HeLa Kyoto cells after incubation of fluorophores 2-8.

さらにMatileらは先ほどのHeLa Kyoto細胞の顕微鏡写真を撮影することに成功しています。この結果から蛍光団が導入された環状ジスルフィド化合物3と4は細胞表面のチオールにトラップされているだけではなく、細胞内に取り込まれていることが確認できます。化合物3と4のCSSC二面角の差はわずか8°であるにもかかわらず(図 4)、この環歪みの小さな差が非常に有意に働いていますね。

図4 CLSM images of HeLa Kyoto cell after incubation of 3 and 4.

このように、細胞取り込みを促進する分子として大きな環歪みを持ったジスルフィド化合物に着目し、この環歪みが細胞取り込みに大きな影響を与えることを明らかとしました。膜透過の機構に関してはまだ十分な議論がされていませんが、 彼らは今回の手法が一般的なエンドサイトーシスとは異なる機構で起こっている可能性を指摘しています。本研究は、膜透過を促進する小分子設計の新しいコンセプトを提案しただけでなく、その膜透過の機構という基礎研究の観点からも面白い内容だと思います。

関連書籍

参考文献

• Torres, A.; Gait, M. Trends in Biotechnology 2012, 30, 185. DOI: 10.1016/j.tibtech.2011.12.002
• Gasparini, G.; Bang, E.-K.; Molinard, G.; Tulumello, D.; Ward, S.; Kelley, S.; Roux, A.; Sakai, N.; Matile, S. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 6069. DOI: 10.1021/ja501581b

外部リンク

• Matile group
• 膜透過性ペプチド | Cell Penetrating Peptide (CPP) | アミノ酸・ペプチド・タンパク質 | フナコシ
• 膜透過性ポリジスルフィド（CPDs）を用いた細胞内導入