先日、冷凍食品を見ながら思いついたようにつぶやいた”凍結”反応ですが、よく調べてみると、他にも面白い論文が昨年報告されていました。
反応性が高いから冷やすのではなく、熱い二人を冷やして近づかせるChemistry。良いもの作れますよ!
さて、その気になる論文は、こちらになります。
”Accelerated Polymer-Polymer Click Conjugation by Freeze-Thaw Treatment”
Bioconjugate Chemistry, 23, 1503-1506, 2012
Hiroyasu Takemoto , Kanjiro Miyata , Takehiko Ishii , Shota Hattori , Shigehito Osawa, Nobuhiro Nishiyama, and Kazunori Kataoka
東京大学大学院工学研究科 片岡一則研究室のお仕事です。片岡先生は高分子で大変著名な先生で、第30代会長でも歴任しています。先日紹介したお仕事は理研の伊藤主任研究員のものでしたが、それ以外にも凍結を使っているとグループがあるということは､もしかしたら日本は凍結化学に強いのかもしれません。
その真偽はともかく、まずはグラフィカルアブストラクトを見てみましょう。
わかりやすいグラフィカルアブストラクトですね。やっていることが一目で理解できます。なお、Conjugation! がCongratulations!に空目したのは私だけでしょうか?
さて、本題に入ります。反応させたい分子はsmall interfering RNA(siRNA)とPEG分子です。高分子に限らず、生体高分子を高分子で修飾するのは一般的に非常に困難です。反応率が低いことがその主要因ですが、高分子同士のごく一部の官能基が選択的に反応しなければならないからと考えれば、その反応率の低さは理解しやすいかと思います。
それでもできるだけ選択的に高分子同士を反応させようということから、シクロオクチンとアジドの間で起こるクリック反応を、複合体化の反応に採用しております。
だからといって、ただ混ぜただけではそうはうまく”クリック”されるわけではありません。やはり高分子反応は収率が低いものです。
では反応性をあげるためにはどうしたらよいでしょうか。一般的には、
1. 反応温度を上げる。
2. 濃度を上げる。
の二つが考えられますね。しかし、1.に関しては生体分子が高い温度条件下において一般に不安定であるため難しい。しかも、反応性の高い官能基が多いので、様々な予期せぬ反応が起きてしまいます。さらには、2本鎖核酸の解離も起き、結果として生体分子の構造が破壊され本来の生物活性が失われてしまいます。
では、次に取りうる方法の2ですが、貴重な生体高分子の濃度を上げろと言われても、そんな量を用意するのはコストの上で問題があります。
そこで筆者らが採用したのが、凍結濃縮現象です。凍結濃縮現象とは、溶液を凍結する際に、局所的に溶液が濃縮されたミクロドメイン構造が形成される現象のことを指しています。溶媒が結晶化して行くにつれて、溶質分子が追いやられて集積していきます。結果として生じた濃縮溶液は凝固点降下により凍結が遅れるため、反応性の高い溶液層が一時的に形成されます。ちょうど図の真ん中の状態（Frozen State)に相当します。なお、この凍結濃縮現象は食品業界ではよく使われる濃縮法のようです。
・・・と書きながら気がついたのですが、スポーツドリンクを凍らせて持って行ったことは皆さんありますよね。これ、中途半端に溶けた状態で飲むと、えらく濃いですよね。そして最後は水っぽくなるわけです。そう、簡単にいえばこれなんですよ、凍結濃縮現象とは。
結果として、実際にこれら高分子同士を、-30 ℃で凍結させた後に4 ℃で解凍する簡便なプロセスを施すだけで反応率が飛躍的に向上したようです。そしてこの凍結解凍プロセスを経て生成したPEG-siRNA複合体は通常のsiRNAの生物活性と遜色が無かったと言うことです。低温下で行ったことにより、余計な副反応が起きなかった間接的な証拠であると言えます。誰でもできる、有効な生体高分子反応プロセスではないかと思います。
高分子反応でお困りの方、とりあえず冷凍庫に反応容器を持って行ってはいかが?
