スローンケタリング癌研究所・Samuel J. Danishefskyら共同研究グループは、Dーアミノ酸のみで構成された変異Rasの全合成に成功した。Rasはヒトのガンの30％に関わるとされるタンパク質であるが、これを標的とする薬剤開発は現在でもさほど進んでいない。全合成された鏡像体Rasタンパク質は、ペプチド阻害剤探索法（mirror-image yeast surface display）に活用できる。

“Total Chemical Synthesis and Folding of All-l and All-d Variants of Oncogenic KRas(G12V)”
Levinson, A. M.; McGee, J. H.*; Roberts, A. G.*; Creech, G. S.; Wang, T.; Peterson, M. T.; Hendrickson, R. C.; Verdine, G. L.; Danishefsky, S. J.* J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 7632–7639. DOI: 10.1021/jacs.7b02988（アイキャッチ画像は本論文より引用・改変）

問題設定と解決した点

　Rasタンパク質は、GTP結合タンパク質の一種で、細胞のガン化に関わるひとつとして知られている[1]。通常、RasはGDPと結合した不活性な状態で存在するが、これがGTPと交換されることで活性化し、転写や細胞増殖に関わる多くのシグナル経路を活性化するようになる。その後GTPase活性化蛋白質(GAP）と結合しGTPをGDPに加水分解することで再び不活性型に戻る。

図はこちらのサイトより引用

　しかしGTPには結合するがそれを加水分解できない変異Rasが生じると、下流のシグナル経路が常時活性化され続ける。これが細胞のガン化を引き起こす。そのため変異したRas(Gly¹²がValへと変異したG12V体が代表的であり、KRasと呼ばれる)の働きを抑制する抗がん剤の研究が行われてきた。しかしながら、Rasは疎水性の結合ポケットを持たず、GTP結合部位を狙っても多量の体内GDP・GTPとの競合に薬剤が負けてしまう問題があり、Rasをターゲットとした低分子創薬は長年にわたり困難であった。

　そこで近年では、下流に位置するキナーゼとRasのタンパク間相互作用を阻害するための研究が行われてきた。その探索法の一つが、Yeast Surface Display（YSD）[2]である。この手法では酵母表面にペプチドを発現させてライブラリとし、標的と結合しうる酵母（ペプチド）のみを集め増幅させ、結合能の高いペプチドを同定する。

YSDの概念図。この図では釣り上げにmagnetic beadsを用いているが、今回の論文ではビオチンを用いている。

　D-アミノ酸から構成されるD-ペプチド医薬は、ペプチダーゼ耐性が高く体内安定性に優れている。しかしながら、酵母表面にD-ペプチドは発現できないため、通常の方法ではYSD法でのD-ペプチド同定は不可能である。

　そこで著者らは、酵母表面L-ペプチドとの相互作用を狙ったmirror-image display screening[3]を実施すべく、すべてがD-アミノ酸で構成された鏡像体KRasの全合成を行った。

技術や手法のキモ

　KRasは166残基もの長さを持つペプチドである。そのため複数のフラグメントに分割し、それぞれ固相合成したものをNCLによって繋げることを計画した。KRasは３ヶ所にシステインを持つ（Cys⁵¹, Cys⁸⁰, Cys¹¹⁸)ため、ここで繋げるのが基本戦略となる。またC末端には釣り上げのためビオチンタグを付けている。

図は論文より引用

　固相上でペプチド鎖を伸ばしていくと、5～20個程度繋げたところでペプチド鎖同士が水素結合などを起こして凝集し、反応しなくなる可能性がある。

　これを解決しうる工夫として、セリン・スレオニンをアセタール保護してプロリン様構造としたジペプチドを組み込んで用いている（プロリン骨格が含まれると凝集しにくいため）。

また、高疎水性部のグリシンアミドにHmb基を導入し、アミドNHが水素結合しないようにしている(Hmbは90% TFAの酸条件で除去可能)。

[118-166]の49残基フラグメントについては固相合成のみでは収率が低いため、フラグメントをAla¹⁴⁶の左右で分割し、NCLで連結して合成している（NCL後のシステインを脱硫してアラニンへと変換している）。Gly¹³³のC末をチオ酸にしたのちイソニトリル活性化型カップリング[4]する別法も検討されている。

合成スキームは論文より引用

[1-50]と[51-79]のNCLにおいては、[51-79]のC末端もチオエステルであるが、[1-50]のC末が優先的に反応する。これは[1-50]C末端を脱離能が大きいアリールチオエステルとしていることが理由であり、Kinetic NCLと呼称している。

合成スキームは論文より引用

主張の有効性検証

①化学合成タンパクが生物合成タンパクと同じものであることの実証

　化学合成後フォールディングさせ、サイズ排除クロマトグラフィーで精製すると、生物合成によるrecombinantタンパクと同じ溶出時間を示した。また。CDスペクトルも同様であった(LとDで逆の波形になる)。タンパク質の吸光(A₂₆₀/A₂₈₀)も同様の結果を示した。

②KRasの鏡像異性体毎にL-ペプチド/D-ペプチドの相互作用傾向が反転することの実証

　KRasと結合して蛍光を発するmant-GppNHpを用い、蛍光強度からL-KRas、D-KRasそれぞれと相互作用するか否かを調べた。mant-GppNHpと結合させた状態でGppNHpと競合させると蛍光が減少していくが、225-44ミニタンパクと相互作用させるとmant-GppNHpの放出（蛍光減少）が遅くなることが知られている。

　このアッセイ系をL-KRasとD-KRasに対し適用したところ、L-KRasは生物合成のものと同様の挙動を示した。

　しかしD-KRasの場合はGppNHp と競合せず、GppNHpの光学異性体と競合して蛍光を減少させた。また、L-225-44 ミニタンパクを共存させても放出を抑制できず、D-225-44ミニタンパク共存下では蛍光減少が遅くなった。

　さらに、KRasに結合する225-11ミニタンパクについてもそれぞれall-D, all-Lのものを用意し、結合力を測定した。この結果、L-KRasとL-225-11、D-KRasとD-225-11が相互作用し、L-RasとD-225-11は相互作用しないことが分かった。

　このように結合特性はL/Dで綺麗に反転していることから、D-KRasと相互作用するL-ペプチドを見つけられれば、L-KRasと相互作用するD-ペプチドを見つけたことに相当する。

議論すべき点

• mirror-image displayは1996年のScience[3a]が初出。これ以降、アルツハイマーやHIV薬の探索のために研究されているようだが、創薬標的となるタンパク質をすべてD体で全合成しなければならないことが欠点。今回のKRasは166残基でまだ合成可能なサイズだが、これ以上大きくなると厳しいか。そもそも化学合成後、ちゃんとfoldingするかどうかも懸念がある。
• この方法で見つけられるのは全てD-アミノ酸からなるペプチドである。DL混合のものなどを見つけることは、当然ながら無理。
• Dｰアミノ酸は終止コドンに対応させれば1~2種程度は導入できるが、すべてをD体にするメリットはどれほどか？

次に読むべき論文は？

• 本手法のlimitationのひとつは、標的タンパク質のD体アミノ酸での全合成である。現在ではどのくらいの大きさのタンパク質まで合成できるのか？を知る意味でも、タンパク質化学全合成に関する総説[5]などは参照価値がある。

参考文献

1. Cox, A. D.; Fesik, S. W.; Kimmelman, A. C.; Luo, J.; Der, C. J. Nat. Rev. Drug Discov. 2014, 13, 828. doi:10.1038/nrd4389
2. Gera, N.; Hussain, M.; Rao, B. M. Methods 2013, 60, 15. doi:10.1016/j.ymeth.2012.03.014
3. (a) Schumacher, T. N. M.; Mayr, L. M.; Minor, D. L.; Milhollen, M. A.; Burgess, M. W.; Kim, P. S. Science 1996, 271, 1854. DOI: 10.1126/science.271.5257.1854 (b) Funkea，S. A.; Willbold, D. Mol. Biosyst. 2009, 5, 783. doi:10.1039/B904138A
4. Roberts, A. G.; Johnston, E. V.; Shieh, J.-H.; Sondey, J. P.; Hendrickson, R. C.; Moore, M. A. S.; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 13167. DOI: 10.1021/jacs.5b08754
5. Kent, S. B. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 338. doi:10.1039/B700141J

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cosine

博士(薬学)。Chem-Station副代表。現在国立大学教員として勤務中。専門は有機合成化学、主に触媒開発研究。 関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。 素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

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