2015年、東京工業大学・中村浩之らは、ルミノール誘導体と鉄-ポルフィリン複合体（ヘミン）を用い、チロシン選択的なタンパク質修飾法を開発した。水系溶媒にて高収率で進行する本反応は、酵素や抗体などにも適用可能である。
“Tyrosine-Specific Chemical Modification with in situ Hemin-Activated Luminol Derivatives”
Sato, S.; Nakamura, K.; Nakamura, H.* ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2633. DOI: 10.1021/acschembio.5b00440
問題設定と解決した点
タンパク質修飾反応において、リジン（Lys）やシステイン（Cys）ほど側鎖反応性が高くなく、適度な表面露出度を持つチロシン（Tyr）側鎖は有力な標的である。Tyr選択的反応の代表格としてはBarbasらが報告したPTAD法[1]がある。しかしながら、PTAD試薬は水中で窒素と一酸化炭素を発生しつつ分解してイソシアネートを生じ、これがLys側鎖と交差反応を起こす問題がある。
そこでPTADと同様に酸化的に活性化されるルミノール誘導体に注目し、副生成物を生じることなくTyr修飾を行う手法を開発した。
技術や手法の肝
ルミノール反応は、血中の鉄触媒を用いて過酸化水素でルミノールを活性化し、基底状態に戻るときに発光を伴う反応である[2]。これはPTADを系中発生させる酸化過程に類似していることから、ルミノールもTyr修飾に使用可能と推測された。しかしルミノールは活性化状態からの分解が速いため、Tyr修飾の収率は21%にとどまった。そこで脱窒素が起こらないよう、窒素メチル基を導入した誘導体を合成し使用した。これはルミノールと異なり発光分解を起こさず、触媒量のヘミン存在下に95％以上の収率でTyr修飾が進行した。
主張の有効性検証
①PTADのような副反応を起こしていないことの確認
反応の検証にはアンジオテンシンⅡ(DRVYIHPFHL)を用いた。Tyr以外に反応していないことを示すため、TyrをAla, Cys, Lys, Met, Ser, Trpに置換したものでも反応を行ったところ、Cys以外は反応が進行しないことが分かった（Cys側鎖は酸化される）。
②タンパク質への適用可能性
基質としてBSA(Tyrを20個含む)を用い、100当量の試薬を用いて反応を行った。反応後のタンパクをMALDI-TOF-MS解析したところ、ピークシフトからおおよそ平均６つの分子が結合していることが分かった。LC-MS/MS解析の結果、20個のTyrのうち8つに結合しうることが示された。
BSAの結晶構造[3]から計算したSolvent Accessibility（SA）と反応位置の相関を考察している。SAが０と計算されるものが反応するなど一部例外もあるが、おおむね反応しやすさと露出度には相関があると考えられる。もっとも反応しやすいTyr400では二重修飾体を与えている。
③タンパク質機能に与える影響
アジド基を備えた試薬を結合し、Click反応で蛍光分子を結合可能であることが実証されている。さらに酵素(Carbonic anhydraseおよびTrypsin)を修飾し後に活性を調べたところ、やや低下は見られるものの概ね活性を保持したままであることが分かった。また反応を抗体にも適用しており、チューブリン抗体に蛍光分子を結合させてチューブリン染色に使用可能であることも実証している。
議論すべき点
- Buffer中で行える反応だが、DMSOを2％混合している。ヘミンと試薬の水溶性に難があるのかもしれない。
- システイン以外には言及していないが、過酸化水素活性化触媒を用いる都合、酸化的なダメージがタンパクに入る可能性は否定できない。
- Tyrの位置選択性制御は次なる課題と言えそう。
次に読むべき論文は？
- 本反応の改良として、ヘミンの代わりにHorseradish-Peroxidaseを用いた反応[4]を報告している。この酵素は活性が高く0.1 mol%で反応が進行すること、NADHを用いることで分子酸素を酸化剤として用いることが可能となった。ルミノール誘導体の試薬構造は同一である。
参考文献
- Ban, H.; Gavrilyuk, J.; Barbas, C. F. III J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1523. DOI: 10.1021/ja909062q
- Merenyi, G.; Lind, J.; Eriksen, T. E. J. Phys. Chem. 1984, 88, 2320. DOI: 10.1021/j150655a027
- PDB: 4F5S
- Sato, S.; Nakamura, K.; Nakamura, H. ChemBioChem 2017, 18, 475. DOI: 10.1002/cbic.201600649
