[スポンサーリンク]

一般的な話題

比色法の化学(前編)

[スポンサーリンク]

比色法を知っていますか?

試薬等を用いてサンプルを発色させ、その発色度合いから濃度等を測定する方法です。この比色法は食品化学、環境分析、生化学など多くの分野において大活躍している方法です。

このトピックでは比色法が具体的にどの分野で、どのように役にたっているのか、また、その方法と原理を簡単に紹介します。

5分で理解!比色法

比色法は数ある測定方法の中でももっとも簡単な原理かもしれません(それだけに奥が深いのですが・・・)。でも、このサイトを御覧になっている方の中には知らない方もいるかもしれないので、基本原理を簡単に説明します。

例えば、測定したい化合物をAとします。このAに発色試薬を混ぜると化学反応が起こり、AはBという化合物になります(図1)。

 

hisyoku1

このBに色がつくので、この濃さを数値化し、間接的にAの濃度を測定するのです。もし、Aの濃度と生成物Bの濃度が比例するならば検量線を引くことにより、Bの色の濃さからAの濃度を決定することができます(図2)。

細胞死を評価する。 〜MTT法〜

   培養細胞を用いた細胞毒性試験や細胞死の経路の解明は、人の疾病の治療法開発の手がかりとなるため、分子生物学者をはじめとする多くの学者によって研究されています。では、細胞が死ぬというのはどういうことなのでしょう?これは突き詰めていくと難しい問題なのですが、学術的な見地からは細胞死はトリパンブルー色素排除試験 (1)MTT法等を用いた比色法 (2)アラマーブルーを用いた蛍光法による方法が認められています。

 そこで今回は比色法の例として、MTT法(MTT assay)を紹介します。MTTとは分子式C18H16BrN5Sで示されるテトラゾリウム塩の一種です。MTTは細胞内に取り込まれると細胞内のミトコンドリアという器官の中にある脱水素によってホルマザン(Formazan)に変化します。このホルマザンは青色の非水溶性結晶であり、生成後は沈殿します1)。これをDMSOなどの有機溶媒で溶解させ、よく混ぜると均一の赤紫色の溶液となるので、この溶液の570 nmにおける吸光度を測定します。

図3  MTT法の原理

MTT自身は水溶性で黄色の溶液ですが、図3のように脱水素酵素による反応によって、MTTとNADHの間に酸化還元反応が起こり、MTTがFormazanに還元され、NADHがNAD+に酸化されます。この脱水素酵素はミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素で、細胞の健康状態の指標となります。細胞が元気な場合は酵素活性が高いのでFormazanへの還元が起こるが、細胞が弱っている場合はそれがあまり起こらず、細胞が死んでいる場合はほとんど起こりません。この度合いが色の濃さに反映されます。つまり、酵素活性の度合いが色の濃さとなって表れているということです。また、健康な細胞においては細胞数とFormazanの青色色素の濃度との間に良好な検量線を引くことができる(図2でいうと横軸が細胞数、縦軸が赤紫色素の濃さ(吸光度として測定)となる)ので、細胞数計測にも利用されています。

 

実験方法

せっかくなので実験方法を簡単に説明しましょう。詳しくは論文等に載っていますのでそちらをご参照下さい。2), 3)

1. 培養細胞をマルチウェルプレート等に等量ずつ蒔く。
2. MTTは予めPBS(生理食塩水)に溶かしておく。
3. 試験をする時はコントロール群(通常の培養液のみ)と薬剤投与群(薬剤を含む培養液)を同時間、インキュベートする。
4. その後、各群を通常の培養液に交換し、2で作成したMTT溶液を加えて、3時間、インキュベートする。
5. 培養液を除去し、DMSOを入れて、沈殿したホルマザンをよく溶かして、均一な溶液にする。
6. 570 nmの吸光度を測定する。
7. 細胞生存率はコントロール郡を100%として、薬剤投与群のコントロールに対する割合で評価する。

実際にマルチウェルプレート上で試験をすると図4のようなイメージになります。

薬剤Aが濃度依存的に細胞毒性を示していることがMTT法でわかります。学術論文等ではこれを評価し、統計学的に差があることも示します。

いかがでしたでしょうか。このトピックで紹介したテトラゾリウム塩の還元を用いる比色法は、細胞毒性の測定みならず、活性酸素の測定などにも用いられます(NBT(ニトロソブルーテトラゾリウム)を使います)。

後編では食品化学において用いられる比色法について紹介しようと思います。

 

(2005.5. 18 まろ)
※本記事は以前より公開されていたものをブログへ移行したものです。

参考文献

  1.  Mosmann, T., “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.” J. Immunol. Methods 1983, 65, 55-63.
  2. Pereira, C., Oliveira, C.R., “Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis.” Neurosci. Res. 2000, 37, 227-236.
  3. 同仁化学研究所(株)プロトコル集より
  4. MTTの生物学的な反応機構: Liu, Y. et al., “Mechanism of Cellular 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H Tetrazolium Bromide (MTT) Reduction.” J. Neurochem. 1997, 69, 581-593.

関連書籍

 

関連リンク

 

cosine

cosine

投稿者の記事一覧

博士(薬学)。Chem-Station副代表。現在国立大学教員として勤務中。専門は有機合成化学、主に触媒開発研究。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

関連記事

  1. 次なる新興感染症に備える
  2. 化学者のためのエレクトロニクス講座~5Gで活躍する化学メーカー編…
  3. 有機化学を俯瞰する -有機化学の誕生から21世紀まで–【後編】
  4. 多才な補酵素:PLP
  5. リガンド指向性化学を用いたGABAA受容体の新規創薬探索法の開発…
  6. リガンドによりCO2を選択的に導入する
  7. 留学せずに英語をマスターできるかやってみた(2年目)
  8. ヒト遺伝子の ヒット・ランキング

コメント、感想はこちらへ

注目情報

ピックアップ記事

  1. 芳香族化合物のニトロ化 Nitration of Aromatic Compounds
  2. 新課程視覚でとらえるフォトサイエンス化学図録
  3. 英グラクソスミスクライン、抗ウイルス薬を大幅値引きへ
  4. 【書籍】イシューからはじめよ~知的生産のシンプルな本質~
  5. Nanomaterials: An Introduction to Synthesis, Properties and Applications, 2nd Edition
  6. 化学物質でiPS細胞を作る
  7. Goodenough教授の素晴らしすぎる研究人生
  8. リケジョ注目!ロレアル-ユネスコ女性科学者日本奨励賞-2013
  9. ガボール・ソモライ Gabor A. Somorjai
  10. ケムステが化学コミュニケーション賞2012を受賞しました

関連商品

ケムステYoutube

ケムステSlack

注目情報

注目情報

最新記事

【マイクロ波化学(株)環境/化学分野向けウェビナー】 #CO2削減 #リサイクル #液体 #固体 #薄膜 #乾燥 第3のエネルギーがプロセスと製品を変える  マイクロ波適用例とスケールアップ

<内容>本イベントでは、環境/化学分野の事業・開発課題のソリューションとして、マイクロ波をご紹介…

医療用酸素と工業用酸素の違い

 スズキは29日、インドにある3工場の生産を一時停止すると明らかにした。インドでは新型コロナウイルス…

世界初のジアゾフリーキラル銀カルベン発生法の開発と活性化されていないベンゼノイドの脱芳香族化反応への応用

第310回のスポットライトリサーチは、千葉大学大学院医学薬学府 (根本研究室)・伊藤 翼さんにお願い…

キムワイプをつくった会社 ~キンバリー・クラーク社について~

Tshozoです。本件先日掲載されたこちらのArticleの追っかけでネタ色が強いですが書いてみるこ…

Advanced Real‐Time Process Analytics for Multistep Synthesis in Continuous Flow

In multistep continuous flow chemistry, studying c…

三角形ラジカルを使って発光性2次元ハニカムスピン格子構造を組み立てる!

第309回のスポットライトリサーチは、木村舜 博士にお願いしました。金属と有機配位子がネット…

第148回―「フッ素に関わる遷移金属錯体の研究」Graham Saunders准教授

第148回の海外化学者インタビューは、グラハム・サウンダース准教授です。ニュージーランドのハミルトン…

ケムステチャンネルをチャンネル登録しませんか?

5月11日で化学の情報サイトケムステは開設21周年を迎えます。これまで記事中心の活動を行ってきました…

Chem-Station Twitter

PAGE TOP