[スポンサーリンク]

化学者のつぶやき

システインの位置選択的修飾を実現する「π-クランプ法」

[スポンサーリンク]

2016年、マサチューセッツ工科大学・Bradley L. Penteluteらは、ペプチドやタンパク質にπ-クランプ配列 (Phe-Cys-Pro-Phe) を導入することにより、当該配列内のシステイン残基のみを選択的に修飾できる方法論の開発に成功した。

“π-Clamp-mediated cysteine conjugation”
Zhang, C.; Welborn, M.; Zhu, T.; Yang, N. J.; Santos, M. S.; Voorhis, T. V.; Pentelute, B. L.* Nat. Chem. 2016, 8, 120–128. doi:10.1038/nchem.2413

問題設定

従来のタンパク質の位置選択的修飾は他官能基との反応性が低い反応剤や,特定位置での反応を促進させる触媒を用いて達成されていた。
また、システイン(Cys)残基選択的修飾では、マレイミドによるライゲーションもしくはアルキル化が用いられてきたが,これらは位置選択的修飾ができないために利用は限られていた。
タンパク質はその三次元構造により特定の反応や相互作用を制御している事実に照らし合わせれば、特定配列が本反応を加速しうるのではないかとの着想を得て、新たに本手法が見出された。

技術や手法のキモ

著者らはパーフルオロアリール基とCysとの芳香族求核置換反応が、有機溶媒中では進行する一方で水中では反応速度が極めて遅いことを見出していた[1]。
そこで、Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Gly-Leu-Leu-Lys配列(Xaaは任意アミノ酸)のペプチドライブラリーに、ビオチン-パーフルオロアリールプローブ(TEVプロテアーゼで切断可能な配列を組み込んである)を投入し,ストレプトアビジンを用いるpull-down法を適用したところ、Phe-Cys-Pro-Trp配列含有ペプチドが優先的に反応していることが同定された。

さらに9残基からなるペプチド (Xaa-Cys-Pro-Xaa-Gly-Leu-Leu-Lys-Asn-Lys) を基質として反応の検討を行ったところ、XaaがともにPheの場合は定量的な収率が得られるのに対し,Xaaのどちらか一方でもPheからGlyとなった場合や、ProがD-Proとなった場合には収率の大きな低下が見られた。
このようにして最終的にπ-クランプ (Phe-Cys-Pro-Phe)と呼ばれる特殊配列を見いだすことに成功している。

主張の有効性検証

Cys残基を複数含むペプチド・タンパク質において、π-クランプ配列に含まれるCys残基のみを選択的にパーフルオロアリール化できることを以下の実験で示している。

①競合実験

π-クランプを含むペプチドと、π-クランプの一部がGlyに変異したペプチドが競合的に存在する条件下で反応を行ったところ、π-クランプを含むペプチドのみが選択的に、かつ定量的に反応が進行した。

②ペプチドにおける選択性確認実験

N末にCys, C末にπ-クランプを持ち,その間をTEVプロテアーゼによって切断することのできるモデルタンパク質を用いて検討を行った.この結果、π-クランプのCysのみが高い位置選択性で修飾されていることが確認された。

③各種タンパク質への適用

N末にπ-クランプを導入したSortase Aに対し本反応を適用した。Cysを複数含んでいるものの、π-クランプの一か所のみが修飾されていること、また酵素活性が低下しないことが示されている。
また、抗体に対しても応用し、抗体―薬物複合体(ADC)の製造へも応用している。Cysを標的とした位置特異的修飾は既存条件では不可能で有り、ADCは不均質混合物として供給されていた。
著者らはトラスツズマブやセツキシマブにπ-クランプを導入したうえで本反応を行い、π-クランプを含む抗体の選択的な修飾に成功している。また修飾後の抗体は抗原親和性が大きく変化せず、抗原を発現した細胞に対しても結合活性を保っている。

④π-クランプの構造化学・反応機構の示唆

分子動力学計算(MD) を用いたペプチドのコンフォメーション解析や、密度汎関数法 (DFT)による反応エネルギー解析が行われている。これによると、下図の4つ (Clamp, Half-Clamp, Phe-Phe face on, Open) が、π-クランプ配列が取り得る主要な配座となっている。

冒頭論文より引用

このうちClamp構造を取っている場合には,アリール化生成物のエネルギーや遷移状態のエネルギーが特に低くなり有利になる。これはPheの芳香環側鎖がパーフルオロアリール基を認識し、またCysの硫黄原子を活性化するためだと推測されている。また本解析により、π-クランプ配列4番目のPheがアリール化を行うに当たって特に重要であることが見出されている。

冒頭論文より引用

議論すべき点

  • π-クランプの位置がペプチドのアミノ酸配列のC末,N末,中間いずれにおいても非常に良好な収率で得られる。タンパク質の活性中心を避けてπ-クランプ配列を導入することで任意の位置が修飾可能なため、応用の幅は広い。
  • タンパク質が変性せず機能する条件(温度,pHなど)に制約があるように、π-クランプが有効に働く条件の制約はあるか?

次に読むべき論文は?

π-クランプ法の詳細な機構解析を行っている続報が、Pentelute自身らによって報告されている[2]。
π-クランプのProがtrans配座を取ることがパーフルオロアリール基捕捉機能に重要であることや,生成物においてPhe側鎖がパーフルオロアリール基と相互作用していることなどが述べられている。
これらの研究からπ-クランプ配列の変異体である下記ペプチドにおいては、85倍の反応加速効果があることが見いだされている。α-Me-Proによるtrans配座固定と,pyrenyl基とのπ-π相互作用が重要とされる。

参考文献

  1. Spokoyny, A. M.; Zou, Y.; Ling, J. J.; Yu, H.; Lin, Y.-S.; Pentelute, B. L. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 5946. DOI: 10.1021/ja400119t
  2. Dai, P.; Williams, J. K.; Zhang, C.; Welborn, M.; Shepherd, J. J.; Zhu, T.; Voorhis, T. V.; Hong, M.; Pentelute, B. L. Sci. Rep. 2017, 7, 7954. doi:10.1038/s41598-017-08402-2
cosine

cosine

投稿者の記事一覧

博士(薬学)。Chem-Station副代表。現在国立大学教員として勤務中。専門は有機合成化学、主に触媒開発研究。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

関連記事

  1. 元素周期 萌えて覚える化学の基本
  2. 紹介会社を使った就活
  3. バイオ触媒によるトリフルオロメチルシクロプロパンの不斉合成
  4. 細胞内の温度をあるがままの状態で測定する新手法の開発 ~「水分子…
  5. メタロペプチド触媒を用いるFc領域選択的な抗体修飾法
  6. 分子びっくり箱
  7. 塩にまつわるよもやま話
  8. 二重可変領域を修飾先とする均質抗体―薬物複合体製造法

コメント、感想はこちらへ

注目情報

ピックアップ記事

  1. アスパラプチン Asparaptine
  2. カクテルにインスパイアされた男性向け避妊法が開発される
  3. 【書籍】「メタノールエコノミー」~CO2をエネルギーに変える逆転の発想~
  4. 鋳型合成 Templated Synthesis
  5. エヴァンスアルドール反応 Evans Aldol Reaction
  6. SciFinder Future Leaders 2017: プログラム参加のススメ
  7. 有機アジド(4)ー芳香族アジド化合物の合成
  8. キャリー・マリス Kary Banks Mullis
  9. マレーシア警察:神経剤VX検出で、正男氏は化学兵器による毒殺と判定
  10. 高峰譲吉の墓

関連商品

ケムステYoutube

ケムステSlack

注目情報

注目情報

最新記事

富士フイルム和光純薬がケムステVプレミアレクチャーに協賛しました

ケムステVシンポとともにケムステオンライン講演会の両輪をなすケムステVプレミアクチャー(Vプレレク)…

ホウ素でがんをやっつける!

「ホウ素」と言ったときに皆さんは何を思い浮かべますか?鈴木宮浦カップリング、ルイス酸(BF3…

広瀬すずさんがTikTok動画に初挑戦!「#AGCチャレンジ」を開始

TikTok For BusinessとAGC株式会社は、AGCをより多くの人に知っていただくことを…

新規性喪失の例外規定とは?

bergです。今回は論文投稿・学会発表と特許出願を同時に行うための新規性喪失の例外規定の適用手続きに…

新車の香りは「発がん性物質」の香り、1日20分嗅ぐだけで発がんリスクが高まる可能性

「新車の香り」には、がんや生殖障害、子どもの先天性欠損症などを引き起こす可能性があるベンゼンやホルム…

溶液を流すだけで誰でも簡単に高分子を合成できるリサイクル可能な不均一系ラジカル発生剤の開発

第 295 回のスポットライトリサーチは東京大学豊田研究室の博士課程 1 年 岡美奈実さんと修士課程…

Carl Boschの人生 その9

Tshozoです。書いてると色々膨らんで収集がつかなくなりますね。ということで前回の続き。W…

創薬・医療系ベンチャー支援プログラム”BlockbusterTOKYO” ビジネスプラン発表会を開催!

東京都が主催し、Beyond Next Ventures株式会社が運営するBlockbuster T…

Chem-Station Twitter

PAGE TOP