生体外の環境でタンパクを守るランダムポリマーの設計

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化学者のつぶやき

生体外の環境でタンパクを守るランダムポリマーの設計

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カリフォルニア大学バークレー校のTing Xu教授らは、生体外の環境でタンパクを安定化するランダム共重合ポリマーの設計手法を開発し、Science誌に報告しました。

“Random heteropolymers preserve protein function in foreign environments”

Panganiban, B.; Qiao, B.; Jiang, T.; DelRe, C.; Obadia, M. M.; Nguyen, T. D.; Smith, A. A. A.; Hall, A.; Sit, I.; Crosby, M. G. Dennis, P. B.; Drockenmuller, E.; Olvera de la Cruz, M.; Xu, T. Science 2018, 359, 1239. DOI: 10.1126/science.aao0335.

１. 立体構造は、タンパクの機能に不可欠

図1. タンパクの基本構造。

タンパクは、食べたものを消化したり、血液中で酸素を運んだり、光合成によって化学エネルギーを生み出したり、生物にとって大切な役割を担っています。その化学構造は一見単純で、図1のようにアミノ酸が繰り返しつながった構造をしています。このアミノ酸が連なった鎖が折りたたみ、立体的な高次構造をとることで、様々な機能を発揮できるようになります。

しかしこの高次構造は、水素結合や疎水性相互作用などの複数の弱い相互作用によってできているため、周りの環境にとても敏感です。生体外の環境では、温度やpH、塩濃度などの条件が合わず、壊れて凝集してしまうことがよくあります。特に、有機溶媒中でタンパクの機能を保つことは難しく、既存の手法では酵素の活性を20%程度保つのがやっと、というところです。有機溶媒中でタンパクを扱えるようになれば、酵素による化合物合成や汚染物質の浄化といった産業利用において、応用の幅がかなり広がるはずですが、タンパクの不安定さがその道を阻んでいます。

そこで今回、Ting Xu教授らは、タンパクの立体構造を安定化させるためのポリマーを開発しました。このポリマーを溶液に混ぜるだけで、タンパクが細胞外の環境でもうまく折りたたまれたり、有機溶媒中で高い活性を保たれるということが示されました。

２. 秘訣はモノマーの構成比とその分布

タンパクの立体構造を安定化するには、タンパクの周りに取り付いて外部環境から守るようなポリマーが理想です。ポリマーとタンパクとの相互作用は強すぎても弱すぎてもいけません。ポリマーとタンパクとの相互作用が強すぎると、タンパクを折りたたんでいる水素結合や疎水性相互作用が影響を受け、立体構造が崩れてしまいます。逆に、ポリマーとタンパクとの相互作用が弱すぎると、ポリマーは溶液中にただ分散し、タンパクを守る働きを成しません。Xu教授らは、タンパクと表面特性の似たポリマーを作れば、タンパクとポリマーが適度に相互作用し、タンパクの立体構造を安定化させられると考えました。

図2. (a) ペルオキシダーゼ（HRP）の表面特性。赤：疎水性、青：親水性、緑：正に帯電、紫：負に帯電。(b) 各タンパクにおける疎水性パッチの大きさの分布。（論文より）

そこで彼女らはまず、よく知られているいくつかのタンパク（α-CT、GFP、GOx、HRP）について表面特性を調べました（図2）。タンパクの表面を、図2aのように疎水性・親水性・正帯電・負帯電部位に分け、各パッチの大きさやパッチ間の距離の統計を取ったところ、いずれのタンパクでもパッチの大きさ・パッチ間距離は1〜2 nmが標準的であることがわかりました。また、タンパクを構成するアミノ酸を疎水性・親水性に分類し、それらのアミノ酸配列における連なり調べると、同じ性質を持つアミノ酸は大抵1〜6個連続して繋がっているだけで、一部に偏っていることはないということが分かりました。

図3. タンパクを安定化するランダム共重合ポリマー。（RHPではi = 5, j = 2.5, k = 2, l = 0.5、Mn = ~30 kDa, PDI = 1.3）

このような分析をもとに、彼女らは図3のようなランダム共重合ポリマーを作りました。このポリマーは、MMA、OEGMA、2-EHMA、3-SPMAという4種類のメタクリル酸エステルから成り、各モノマーは以下のような特性を持っています。

MMA：ポリマー全体の疎水性を向上する。極性・非極性の界面で相互作用できる。
OEGMA：PEGにより、タンパクを安定化する。
2-EHMA：タンパクの疎水部位と相互作用する。
3-SPMA：正電荷をもつタンパクの部位と相互作用する。

このようなポリマーを様々なモノマー組成比で作り、水溶液や有機溶媒中での酵素活性の保持効果を調べたところ、モノマー組成比i = 5, j = 2.5, k = 2, l = 0.5のポリマー（以下、RHPと呼ぶ）が、最大の効果を示すことがわかりました。各モノマーの反応性をもとにモノマー配列をシミュレーションすると、同じモノマーが多数連続して並ぶことはなく、各種のモノマーが偏りなくポリマー鎖全体に分布していることが確認されました。これは、タンパクのアミノ酸配列において、疎水性・親水性のアミノ酸が偏りなく分布している様子をうまく模倣しています。

3. ランダムポリマーRHPは、タンパクの周りを覆う。

図4.（A）トルエン中、（B）水溶液中でのペルオキシダーゼ（HRP）とRHPの様子（論文より）。緑：RHP、赤：タンパクの疎水性部位、青：親水性部位。

Xu教授らは、分子動力学シミュレーション（MD）により、溶液中でのタンパクとRHPの相互作用の様子を調べました。図4から、水溶液中ではタンパクはRHPにほとんどカバーされていないのに対し、有機溶媒のトルエン中では、タンパクの周りをRHPが覆っているということが分かります。また、タンパクの重心と各モノマーとの距離を調べると、トルエン中では、親水性のOEGMAや3-SPMAはタンパクの近くに、疎水性のMMAや2-EHMAはタンパクから遠くに存在していることが分かりました。つまり、RHPは内側に親水性モノマー、外側に疎水性モノマーが配置するようにコンフォメーションを変化させ、タンパクや有機溶媒とうまく相互作用していると言えます。

4. RHPは、有機溶媒中で酵素の活性を保つ。

それでは実際に、RHPはどのような効果を持っているのでしょうか。Xu教授らは、水溶液中でRHPとペルオキシダーゼ（HRP）を混合し、凍結乾燥した後、有機溶媒に分散させました。すると、RHPと混合したHRPは、トルエンやクロロホルムにうまく溶解し、凝集せずに分散することが確認されました。また、トルエン中に分散したサンプルを乾燥させ、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察すると、RHPとHRPが50〜60 nmほどのナノ粒子を形成していることが確認されました（図5a）。

図5. (a) トルエンに分散したRHP/HRPのTEM画像。(b) 各安定化剤（RHP, AOT, PS-b-PEO）を用いた場合のHRPのトルエン中での活性変化。（論文より）

さらに、トルエン中でのHRPの活性を経時的に調べると、RHPと混合した場合には、 24時間後にも活性が80%近く保たれていることが確認されました（図5b）。同様の濃度条件で、他の安定化剤（AOT, PS-b-PEO）を用いたサンプルと比べると、4倍以上もの活性保持率が得られています。さらに、GOxやGFPなど、他のタンパクにおいても、高い活性保持率が得られることが確認されました。

5. おわりに

今回のポリマーのデザイン手法のポイントは、一般的なタンパクの親水性・疎水性パッチの大きさを模倣するということです。得られたポリマーは、自然界に存在する天然変性タンパク（intrinsically disordered proteins; IDP）に似ています。IDPは、特定の高次構造を持たず、他のタンパクと多点で弱い相互作用をすることで、構造の安定化や折りたたみの補助を行っていますが、今回作られたポリマーも、同様の構造・機能を持っていると考えられます。

応用面においては、市販のモノマーをランダムに共重合させるだけで作れること、溶液に混ぜるだけでタンパクを安定化できること、といった利点があります。PEG化（PEGylation）のように、化学反応を用いてポリマーを付加する必要はないので、簡便で、反応性の官能基が少ないタンパクにも有効です。今後、酵素を用いた汚染物質処理や燃料電池、タンパクの構造解析など、多方面での応用が期待されます。