2017年、ボストンカレッジのAbhishek Chatterjeeらは、5-ヒドロキシトリプトファン(5-HTP)と芳香族ジアゾニウムとの高い反応性を、化学選択的なタンパク質修飾法に応用した。形成されるアゾ（N=N）結合は、亜ジチアン酸塩で効率的に開裂できるため、必要に応じて脱修飾を行なうことも可能である。

“A Chemoselective rapid Azo-Coupling Reaction (CARCR) for Unclickable Bioconjugation”
Addy, P. S.; Erickson, S. B.; Italia, J. S.; Chatterjee, A.* J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 11670-11673. DOI: 10.1021/jacs.7b05125

問題設定

芳香族ジアゾニウムイオンを利用したタンパク質修飾法は、チロシンを標的としたFrancisらの報告[1]を代表例としていくつか報告がなされている。しかしながらチロシン残基はタンパク表面にそれなりの数が存在するために選択性が出しづらいこと、またジアゾニウム試薬は強力な電子求引基（ニトロ基など）を備えていないと反応しないため、試薬構造に大きな制限がかかることが問題となっていた。

技術や手法のキモ

著者らはより電子豊富な側鎖を有する5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）を反応相手とすることで、従来よりマイルドな条件でのタンパク質修飾法を達成している。5-HTPはセロトニンやメラトニンの原料となるアミノ酸であり、チロシン以上に側鎖が電子豊富であり、ジアゾニウム試薬との反応性も高い。たとえば4-ニトロフェニルジアゾニウムとの反応では、チロシンの4500倍の反応速度を示している。
しかし、チロシンに対しても遅いながらも反応が進んでしまうため、よりマイルドな試薬である4-カルボキシフェニルジアゾニウム及び4-メトキシフェニルジアゾニウム塩を用いることで、5-HTP選択的に反応を進めている。

主張の有効性検証

①生体条件での交差反応性のチェック

4-カルボキシフェニルジアゾニウム試薬は、チロシン及びヒスチジン、トリプトファン、リジンといった他の天然アミノ酸残基とは一切反応しない。

②タンパク質への応用

著者は最近、大腸菌のtryptophanyl-tRNA synthetase/tRNA対を改変することで、真核細胞内で効率的に5-HTPを導入可能な系を確立することに成功した[2]。これを用いてsupefolder GFPの5-HTP導入体を合成し、反応を行った。5-HTP未導入のNative体と比較したところ、5-HTP導入体のみから修飾体が得られた。

③蛍光性ジアゾニウム化合物による修飾

リンカーを介して繋げるのではなく、試薬相当の部分構造を有するフルオレセインジアゾニウム置換体を用いることで、タンパク質を修飾して蛍光性を付与できることも示している。

④抗体の修飾

ハーセプチンFab断片に5-HTPを導入した抗体断片に対しても、反応は良好に進行する。LC-MS解析で修飾分の分子量が増えていること、SDS-PAGEで調べると蛍光性が付与されていること、抗原であるHER2過剰発現細胞（SK-BR-3）に対し作用させると細胞が光ることから、抗体機能を損ねずに修飾できることが実証されている。

⑤還元による脱修飾

生成物のアゾ構造は亜ジチオン酸塩(Na₂S₂O₄)還元によって、切断(unclick)することができる。このことは低分子モデル化合物のLC-MS解析、および光駆動型ビオチン化試薬[3]を用いるタンパク質修飾→unclickの様子をウェスタンブロッティング（ストレプトアビジン-HRPプローブ）で追跡して確かめている。しかし反応後の4-アミノ-5-HTPは酸化に弱く、MS解析では追跡できていない。

議論すべき点

• 反応は非常に速い。タンパク質相手であっても4-ニトロ型試薬は1～2分、4-カルボキシ型試薬でも20分ほどで反応が完了する。
• 5-HTPは体内にもともと存在するアミノ酸であり、安定で安価という利点はある。また従来法と直交性があるので複数種類の修飾も可能にする。

次に読むべき論文は？

• 本反応＋クリック反応などで複数種類の修飾を導入するためは、追加で天然アミノ酸残基を狙うか、もう一種類の非天然アミノ酸を導入する必要がある。動物細胞で行なうには技術的ハードルがあるが、著者らはそのための手法を最近報告している[4]。
• また著者らは、動物細胞での非天然アミノ酸の導入についてのレビュー[5]も書いている。抗体ほどの巨大分子は大腸菌で作るのが厳しいため、ADCなどへの応用も考えると重要な技術である。

参考文献

1. Hooker, J. M.; Kovacs, E. W.; Francis, M. B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3718. DOI: 10.1021/ja031790q
2. Italia, J. S.; Addy, P. S.; Wrobel, C. J.; Crawford, L. A.; Lajoie, M. J.; Zheng, Y.; Chatterjee, A. Nat. Chem. Biol. 2017, 13, 446. doi:10.1038/nchembio.2312
3. (a) He, J.; Kimani, F. W.; Jewett, J. C. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 9764. DOI: 10.1021/jacs.5b04367 (b) Jensen, S. M.; Kimani, F. W.; Jewett, J. C. ChemBioChem 2016, 17, 2216. DOI: 10.1002/cbic.201600508 (c) Kimani, F. W.; Jewett, J. C. Angew. Chem., Int. Ed. 2015, 54, 4051. DOI: 10.1002/anie.201411277
4. Zheng, Y.; Addy, P. S.; Mukherjee, R.; Chatterjee, A. Chem. Sci. 2017, 8, 7211. DOI: 10.1039/C7SC02560B
5. Italia, J. S.; Zheng, Y.; Kelemen, R. E.; Erickson, S. B.; Addy, P. S.; Chatterjee, A. Biochem. Soc. Trans. 2017, 45, 555. DOI: 10.1042/BST20160336