[スポンサーリンク]

化学者のつぶやき

ファージディスプレイでシステイン修飾法の配列選択性を見いだす

[スポンサーリンク]

2016年、ニューヨーク州立大学バッファロー校のQing Linらは、ファージ支援型反応性調査法(PAIR)を活用し、2-シアノベンゾチアゾール(CBT)反応剤に親和性のあるペプチド配列(CX10R7)を同定し、配列選択的システイン修飾法を確立した。反応剤は可逆結合性を持つので、周囲のアミノ酸配列が付加体を安定化させていることが示唆される。In vitro反応および大腸菌表面タンパクへの反応にも適用可能。

“Sequence-Specific 2‑Cyanobenzothiazole Ligation”
Ramil, C. P.; An, P.; Yu, Z.; Lin, Q.* J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 5499-5502. DOI: 10.1021/jacs.6b00982 (アイキャッチ画像は本論文より引用)

問題設定と解決した点

 天然型レポーターを標的とする配列選択的生体共役反応は、生体高分子のラベリングをより直截的なものとする。しかしながら、非酵素的に特定の短鎖ペプチド配列を認識して進行する一価反応剤の報告は未だ限られている。

 システインはタンパク質一次配列中に希少(ヒトでは2.3%)であり、側鎖はきわめて求核性が高いため、生体共役反応の標的として有用である。システイン周りの環境をチューニングして選択的生体共役反応に導いた例も2例知られている[1]。 著者らはCBT試薬の反応性に着目した。N末Cys(もしくはmasked Cys導入後に脱保護)と縮合させる先例[2]があるが、本論文では特定配列選択的な反応を見いだすに至っている。

技術や手法のキモ

 著者らが独自開発したファージ支援型反応性調査法(phage-assisted interrogation of reactivity, PAIR)[3]によって、CBT試薬に親和性を有するアミノ酸配列を特定するアプローチが取られている。

 本研究では11残基のCys含有ペプチド配列(X5CX5)を提示したファージライブラリと、biotin-PEG-CBT試薬を用いて配列探索を行なっている。CBTとCysの反応は可逆性を持つため、特定配列による安定化を受けない限りは付加体として取れてこない(先例[2]が、N末端チアゾリン形成に限定されている理由)。

主張の有効性検証

 2サイクルの選択プロセスを経てCX10R7配列(VTNQECCSIPM)が同定された。BLAST解析をしても、類似配列は細菌・ヒトプロテオームからは見いだされない、ユニークなものである。

①CX10R7配列の各アミノ酸の役割

 特定配列をC末融合させたユビキチン(Ub)に対しCBT試薬を反応させ、LC-MSで収率を見積もり、各アミノ酸の役割を考察している。

冒頭論文より引用・改変

 立体障害がない配列でも反応しないため、本配列の重要性が示唆される(entry1)。連続するCysは反応性に重要(entry2-5)だが、相加効果ではない(triCys配列では収率が下がる)。7残基にしてもそこそこ収率は保持される(entry6)。近傍の水素結合ドナー性アミノ酸をアラニンスキャンすると反応性が低下する。中でもQ4A変異体が最も劇的(entry7-12)。Q4E変異体では反応性は完全消失(GluはpH8.5で水素結合アクセプターになる、entry13)。Gln4が水素結合ドナーとして、付加体の安定化に主要な役割を担うと考察される。リジンスキャンでも反応性は低下する(entry14-19)が、アラニンスキャンに比べて低下度は小さいので、極性官能基が付加体の安定化に重要であることが示唆される。

②CBT試薬構造の重要性

様々な試薬構造をUb-CX10R7に対して反応させたところ、シアノ基の求電子性と反応性は概ね相関していることが分かった。CBT構造は必須であり、そのほかの類似構造は反応性を持たないか、選択性が出ない(コントロールとしてUb-GGCGGを用いている)。

冒頭論文より引用・改変

③条件の最適化

Ub-CX10R7を用いて検討し、PBSバッファ、pH 7.4、37℃、1hを最適条件としている。本条件における二次反応速度定数は17 M-1s-1であり、先例[2]で求められたN末Cys縮合に比べて2倍程度速い。ビオチン結合体ではこの結果だが、ビオチンを蛍光団に変えると反応しなくなる。遠隔官能基もCX10RX7配列と何らかの相互作用をしているのではないか。

④基質の検討

 superfolder GFP(sfGFP)のCX10RX7融合体に対してbiotin-PEG-CBT試薬を反応させると、65%収率で付加体が得られる。野生型sfGFPはフリーの表面Cysを二つ(Cys48、Cys70)もつが、これらは反応しない。ストレプトアビジンブロット法でも検出が可能であることから、変性過程・電気泳動・ブロッティングの最中にもCBT-Cys結合は安定に存在することが示唆される。

冒頭論文より引用

 細胞表面反応も可能であることが実証されている。大腸菌に膜タンパクOmpX-CX10R7を発現させたものに対して、biotin-PEG-CBT試薬を反応させてビオチン化を行なった(コントロールとしては主要残基を全てアラニンに変えたOmpX-A7を用いている)。アビジン―赤色蛍光分子(AlexaFluor568)標識体で検出したところ、OmpX-CX10R7を発現している菌の、特にタンパク質が発現している部分だけが反応している(=赤色蛍光を発する)ことが分かった。

冒頭論文より引用

議論すべき点

  • ある程度安定な結合とはいえ可逆性があるので、抗体―薬物複合体の製造目的などに応用するときには一考が必要だろう。
  • 配列の分子認識過程が精密かつ複雑化するにつれ、試薬に搭載可能な原子団にも制限がかかりはじめることは、生体共役反応一般に起こりえるものと理解しておくべきか。

次に読むべき論文は?

  • 化学修飾型encodedライブラリの総説[4]。各技術の特徴を踏まえ、生体共役反応探索に使えるかどうかを考えたい。ファージディスプレイは低pH水溶液にさらすとファージの感染性がなくなってしまうこと、提示ライブラリの多様性に制限があることなどが懸念点である。

Appendix

ファージ支援型反応性調査法(PAIR)[3]について

ファージディスプレイ分子探索を、生体共役反応の配列選択性同定に応用した手法。大まかな手順は以下の通り。

  1. ビオチンタグ付けした試薬をM13ファージライブラリと反応させ、固定アビジンで反応したファージを選択的に釣ってくる
  2. 反応しなかったファージを洗い落とす
  3. 反応したファージをビオチン競合によって溶出させる
  4. ファージに含まれる遺伝子配列をPCRで読む
  5. ファージを大腸菌に感染させて増幅させる

以上を繰り返すことにより、試薬と反応する特定配列を有するファージだけが淘汰・増幅されていき、配列選択性を見積もることが出来る。

画像は冒頭論文SIより引用

参考文献

  1. (a) Chen, Y.; Clouthier, C. M.; Tsao, K.; Strmiskova, M.; Lachance, H.; Keillor, J. W. Angew. Chem., Int. Ed. 2014, 53, 13785. DOI: 10.1002/anie.201408015 (b) Zhang, C.; Welborn, M.; Zhu, T.; Yang, N. J.; Santos, M. S.; Van Voorhis, T.; Pentelute, B. L. Nat. Chem. 2016, 8, 120. doi:10.1038/nchem.2413
  2. (a) Ren, H.; Xiao, F.; Zhan, K.; Kim, Y.-P.; Xie, H.; Xia, Z.; Rao, J. Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 9658. DOI: 10.1002/anie.200903627 (b) Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 11418. DOI: 10.1021/ja203111c
  3. Lim, R. K. V.; Li, N.; Ramil, C. P.; Lin, Q. ACS Chem. Biol. 2014, 9, 2139. DOI: 10.1021/cb500443x
  4. Heinis, C.; Winter, G. Curr. Opin. Chem. Biol. 2015, 26, 89. doi:10.1021/cb500443x

 

The following two tabs change content below.
cosine

cosine

博士(薬学)。Chem-Station副代表。現在国立大学教員として勤務中。専門は有機合成化学、主に触媒開発研究。 関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。 素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

関連記事

  1. SDFって何?~化合物の表記法~
  2. 天然物の全合成研究ーChemical Times特集より
  3. リガンド革命
  4. Wileyより2つのキャンペーン!ジャーナル無料進呈と書籍10%…
  5. 銀の殺菌効果がない?銀耐性を獲得するバシラス属菌
  6. Al=Al二重結合化合物
  7. 酵素触媒によるアルケンのアンチマルコフニコフ酸化
  8. ルテニウム触媒を用いたcis選択的開環メタセシス重合

コメント、感想はこちらへ

注目情報

ピックアップ記事

  1. ライバルのラボで大発見!そのときあなたはどうする?
  2. 藤田 誠 Makoto Fujita
  3. Reaxys PhD Prize再開!& クラブシンポジウム2019参加者募集
  4. 図に最適なフォントは何か?
  5. ノーベル賞への近道?ー研究室におけるナレッジマネジメントー
  6. 世界の中心で成果を叫んだもの
  7. 東日本大震災から1年
  8. 不活性アルケンの分子間[2+2]環化付加反応
  9. 超分子化学と機能性材料に関する国際シンポジウム2016
  10. 水入りフラーレンの合成

関連商品

注目情報

注目情報

最新記事

ペプチドの革新的合成

第215回のスポットライトリサーチは、中部大学総合工学研究所分子性触媒センター助教・村松渉先生にお願…

年収で内定受諾を決定する際のポイントとは

転職活動の終盤で複数の企業から内定を獲得した際、「年収が決め手となって内定を受諾…

安定なケトンのケイ素類縁体“シラノン”の合成 ケイ素—酸素2重結合の構造と性質

第214回のスポットライトリサーチは、東北大学大学院理学研究科化学専攻(岩本研究室)・小林 良さんに…

99.7%の精度で偽造ウイスキーを見抜ける「人工舌」が開発される

 まるで人間の舌のように偽造ウイスキーを見抜くことができる小型のセンサーが開発されました。このセンサ…

天然のナノチューブ「微小管」の中にタンパク質を入れると何が起こる?

第213回のスポットライトリサーチは、鳥取大学大学院 工学研究科・稲葉 央 助教にお願いしました。…

有機合成化学協会誌2019年8月号:パラジウム-フェナントロリン触媒系・環状カーボネート・素粒子・分子ジャイロコマ・テトラベンゾフルオレン・海洋マクロリド

有機合成化学協会が発行する有機合成化学協会誌、2019年8月号がオンライン公開されました。ひ…

Chem-Station Twitter

PAGE TOP