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カイザーテスト Kaiser Test

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概要

ペプチド固相合成における縮合反応が完全に進行しないと、最終物として様々な鎖長のペプチドが混合物として得られてくるため、精製が極めて困難となる。

ほぼ100%の収率で進行させることを目的に、固相上の縮合反応を簡便にモニターできる分析法の一つがカイザーテスト(Kaiser Test)である。固相合成におけるTLCのような位置づけであるため、各工程で丁寧にやっておくと高収率・高純度でペプチドを得やすくなる(冒頭画像はこちらから引用)。

原理

固相上でニンヒドリン反応を行い、N末端アミノ基の残存を検出するという分析法に相当する。ニンヒドリンはアミノ基と反応してルーエマン紫という色素を精製する。フェノールはpH調製のため、KCNは中間体の空気酸化を防ぐ還元剤として加えられている[3]

実験手順[1]

レシピ

試薬セットは市販品を購入可能であるが、必要に応じて安価な試薬から自作可能である。下記を混合して個別に調製する。

試験液1

・ニンヒドリン:500 mg
・エタノール:10 mL

試験液2

・フェノール:80 g

・エタノール:20 mL

試験液3

・1mM KCN水溶液:2 mL

・ピリジン:100 mL

プロトコル
  1. マイクロチューブに固相合成レジンを少量すくい取って入れ、MeOHで3回洗浄する(DMFなどを除く)。
  2. 試験液1~3を1滴ずつくわえ、100℃で1分加熱する。
  3. 濃青色~紫色になれば未反応のN末端が存在することを示す。無色~黄色のばあいは、縮合反応が完結していることを示す。

(画像はこちらの動画より引用)

 

未反応のN末端が存在している場合は、同じ縮合条件を繰り返す、縮合条件を変更する、アセチルキャップを行うなどの対処をする。

クロラニルテスト[4]

KaiserテストはN末端が2級アミンである場合(プロリンやN-メチルアミノ酸など)には原理上、適用出来ない。クロラニルテストを用いることでこれが検出可能となる。

レシピ

試験液1

・アセトアルデヒド:1 mL
・DMF:49 mL

試験液2

・クロラニル:1 g

・DMF:49 mL

プロトコル
  1. マイクロチューブに固相合成レジンを少量すくい取って入れ、MeOHで3回洗浄する(DMFなどを除く)。
  2. 試験液1・2を1滴ずつくわえ、室温で5分放置する。
  3. 濃青色~緑色になれば未反応のN末端が存在することを示す。無色~黄色の場合は、縮合反応が完結していることを示す。

NHPIテスト[5]

可逆的にレジンを染められる、新しい検出プロトコルである。N末端の級数やアミノ酸種を問わない、Kaiserテストに含まれる毒性試薬(KCN)の懸念がない、検出に使ったレジンを廃棄しなくて良いの総収率への影響が少ないなど、いくつかの点で改善されている。

レシピ

試験液

・N-ヒドロキシフタルイミド(NHPI)の飽和DMF溶液(~2.7M)

※色の変化が少ない場合はN,N’-ジヒドロキシピロメリチミド(NDHPI)をNHPIの代わりに使うと改善される。

プロトコル
  1. マイクロチューブに固相合成レジンを少量すくい取って入れ、MeOHで3回洗浄する(塩基を除く)。
  2. 試験液をレジンと混合して洗浄、を3回繰り返す。
  3. 赤色~赤茶色になれば未反応のN末端が存在することを示す。無色~黄色のばあいは、縮合反応が完結していることを示す。

(論文[5]SIより引用)

関連動画

 

参考文献

  1. ”Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides” Kaiser,E. T.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Anal. Biochem. 1970, 34, 595. doi:10.1016/0003-2697(70)90146-6
  2. ”Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction” Sarin, V. K.; Kent, S. B. h.; Tam, J. P.; Merrifield, R. B. Anal. Biochem. 1981, 117, 147. doi:10.1016/0003-2697(81)90704-1
  3. “A modified photometric ninhydrin method for the analysis of amino and imino acids.” Troll, W.; Cannan. R. K. J. Biol. Chem. 1953, 200, 803-811.
  4. (a) “A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid Phase Ppetide Synthesis Using Chloranil” Christensen, T. Acta Chem. Scand. B 1979, 33, 763.  [PDF] (b) “Detection of secondary amines on solid phase” Vojkovsky, T. Pept. Res. 1995, 8, 236.
  5. “Stain Protocol for the Detection of N-Terminal Amino Groups during Solid-Phase Peptide Synthesis” Suzuki, R.; Konno, H. Org. Lett. 2020, 22, 3309. doi:10.1021/acs.orglett.0c00445

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博士(薬学)。Chem-Station副代表。国立大学教員→国研研究員にクラスチェンジ。専門は有機合成化学、触媒化学、医薬化学、ペプチド/タンパク質化学。
関心ある学問領域は三つ。すなわち、世界を創造する化学、世界を拡張させる情報科学、世界を世界たらしめる認知科学。
素晴らしければ何でも良い。どうでも良いことは心底どうでも良い。興味・趣味は様々だが、そのほとんどがメジャー地位を獲得してなさそうなのは仕様。

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