光反応性ジアジリンアミノ酸は、レセプターであるタンパク質との間で共有結合を形成するという特性があり、高次構造が変化しても解離することがないため、SDS-PAGEのように変性操作をともなう実験でも使用できる。レセプターとリガンドの結合部位を決定する実験、特にSDS-PAGEを使用する実験を考えておられる方におすすめです。
SDS-PAGEによるタンパク質高次構造の変化
生体内において、レセプターとリガンドは鍵と鍵穴のように結合する相手が決まっており、その結合の結果として様々な現象を引き起こしています。このレセプターとリガンドの相互作用を理解することは生化学や薬理学の研究で最も重要なことの１つです。複数のサブユニットからなるタンパク質でできたレセプターについて、どのサブユニットがレセプターとして働いているのかを知るための方法として電気泳動がありますが、その中でよく使用される手法の一つにSDS-PAGEがあげられます(図1)。SDS-PAGEでは、資料の前処理にSDSを用いてタンパク質の高次構造を壊す必要があるのですが、この時にレセプター(サブユニット)とリガンドが解離してしまっては、リガンドがどのサブユニットに結合していたかわからず役に立ちません。
図1. SDS-PAGEによるタンパク質高次構造の変化 (1)レセプター（複数のサブユニットから成り、4次構造を持つタンパク質） (2)リガンドが結合する (3)電気泳動の前処理によりサブユニットがバラバラになり (4)二次構造もほどけ、一次構造となる
今回紹介する光反応性ジアジリンアミノ酸は、レセプターであるタンパク質との間で共有結合を形成するという特性があり、高次構造が変化しても解離することがないため、SDS-PAGEのように変性操作をともなう実験でも使用できる便利な標識試薬です。
光反応性ジアジリンアミノ酸
ジアジリン部位は、光照射するとカルベンを生じます。カルベンは非常に反応性に富んでいるため、最近接の分子と共有結合する性質をもっています(図2)。
図2, ジアジリンの光照射によるクロスリンク(イメージ)
通常、リガンドは対応するレセプターと水素結合やイオン結合により可逆的な結合を作ります。SDS-PAGEでは前述の通り前処理によってリガンドとレセプターが解離してしまい、どのタンパク質あるいはサブユニットがレセプターとして働いていたのか分からなくなります。しかし、ジアジリンアミノ酸を導入したリガンドを用いた場合、光照射することで最近接分子であるレセプターとの間に共有結合が形成されるため変性条件下でも解離せず、標識したリガンドが結合しているタンパク質を知ることができます。
ジアジリン化合物とアジド化合物の比較
ジアジリンと同様によく用いられるアジド化合物の特徴について比較したものが、表1です。ジアジリンの特徴は、ニトロ化やFriedel-Crafts反応などの過酷な条件に耐えることができるほど化学的に安定で、ペプチド固相合成においても保護せず用いることができるため、様々なリガンドへの導入が可能です。
表1. ジアジリン化合物とアジド化合物の比較
リガンドがレセプターと結合した後の光反応についても、比較的短時間の紫外線照射で反応が進行するため、タンパク質の変性や失活を防ぐことができるという点で有利です。たとえば、リガンドとレセプターを共有結合させるための類似の方法としてアジドへの光照射でナイトレンを生じさせる方法が挙げられます。アジド→ナイトレンの生成にはλ= 300nmの紫外線が必要なのに対して,ジアジリン→カルベンの生成は、アジドの場合に比べてやや長波長(360nm)で反応を進行させることができます。また、ナイトレンよりもカルベンの反応性の方が高いため、より短時間の光照射でスムースに標識反応を進めることができます。
共有結合の強さについても、アジドでのクロスリンクはアミノ酸配列を決めるためのエドマン分解で切断されますが、ジアジリンの場合はその程度で切れることはありません。ジアジリンを標識したリガンドとレセプターが結合しなかった場合、ジアジリンの最近接分子はレセプターではなく周辺に存在する水などの溶媒となり、ジアジリンとレセプターが共有結合を作ることはありません(図3)。合成のしやすさではアジド化合物の方が有利となりますが、SDS-PAGEなど実際の解析操作においてはジアジリンの方が有利となっています。
図3. ジアジリン導入済みリガンドの光反応の様子 (a) 対応するレセプターと結合した場合 (b) 対応するレセプターに結合しなかった場合
TDfを用いた研究
Tdfを利用した最近の研究では、アンギオテンシンⅡがGタンパク共受容体に作用するときのメチオニン(Met)選択性を調べるために、C端にFmoc-Tdfを結合させたペプチドが使用されました(図4-1)。
図4-1. Tdfを利用した研究例(1)
カルベンの高い反応性は、リガンドの結合点を決めるのに非常に便利であるといえます。さらに、Tdfは生化学実験の試薬としてだけでなく、治療薬としての応用が期待されています。例えば、アルツハイマーの治療薬が挙げられます(図4-2)。アルツハイマーの治療としては、アミロイドβの凝集を妨げることが一般に知られています。Kinoらのグループは、アミロイドβに親和性を持つ環状ペプチドにジアジリン部位を導入し、UV照射することによってアミロイドβのTyr10と環状ペプチドのジアジリン部位との間に共有結合を生じることに成功し、その結果アミロイドβの凝集力や毒性を低下させることを報告しています。
図4-2, Tdfを利用した研究例(2)
レセプターとリガンドの結合部位を決定する実験、特にSDS-PAGEを使用する実験を考えておられる方におすすめです。
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