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定量PCR(qPCR ; quantitative PCR)、リアルタイムPCR

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ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、サンプルの中にある特定配列のDNA量を調べる方法。この方法を用いれば、目的遺伝子の発現量やサンプル中のウイルス遺伝子の含有量などを調べることができる。一般的なqPCR法ではリアルタイムで測定が行われるため、「qPCR」と「リアルタイムPCR」は同義として扱われていることが多い。よく用いられるのは、サイバー・グリーン法(SYBR Green)とタックマン・プローブ法(TaqMan Probe)の2種類である。

通常のPCRでは、増幅反応後のDNAサンプルを遺伝子組替えに利用したり、定量に用いたりするため、反応後の生成物のみが興味の対象となるのに対し、リアルタイムPCRではDNAの増幅過程が重要となるため、「リアルタイムPCR」と呼ばれる。qPCRには、増幅後のDNAサンプルを電気泳動で分離して定量する、というリアルタイム測定ではない方法もある。

(ちなみに、バイオ分野でよく目にする ”RT-PCR” という手法は、多くの場合、リアルタイムPCR(real time PCR)でなく、逆転写PCR(reverse transcription PCR)のことを指すので注意。)

1, qPCRの仕組み:SYBR Green法(インターカレーション法)

インターカレーション法では、二本鎖DNAの間に挿入(インターカレーション)する蛍光分子を用いてDNA増幅量を調べる。SYBR Greenという蛍光分子がよく用いられる。

SYBR Green Iの化学構造。

以下に、SYBR Green法の流れを示す。

  1. PCRの反応溶液に、二本鎖DNAに挿入して発光する蛍光分子を混ぜておく。
  2. PCRによってDNAの増幅が起こると、合成されたDNAの間に蛍光分子が挿入し、発光が起こる。
  3. 溶液の発光をモニタリングすることで、DNAの増幅量を調べることができる。

この手法では、目的以外のDNAが非特異的に増幅された場合でも、蛍光分子が発光してしまうという欠点がある。以下に紹介するTaqManプローブ法では、目的のDNAに特異的に発光が起こるという利点がある。

2. qPCRの仕組み:TaqMan Probe法(加水分解プローブ法)

TaqMan Probe法では、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用してDNA増幅の測定を行う。重要なのは、TaqManプローブとTaq DNAポリメラーゼの2つの要素である。

  • TaqManプローブ:FRETを起こす蛍光分子ペアを結合した短い一本鎖DNA。定量したい遺伝子に結合するように、一本鎖DNAの配列は、目的遺伝子との相補的配列としてデザインする。TaqManプローブが加水分解されると、蛍光分子ペアが離れてバラバラになるため、FRETが起こらなくなる。つまり、クエンチされていた蛍光分子が発光できるようになる。
  • Taq DNAポリメラーゼ:DNAを合成するためのポリメラーゼ活性に加え、DNAを5’→3’の方向へと加水分解する機能(5’→3’エキソヌクレアーゼ活性)を持つ。この機能により、DNA増幅の際にTaqManプローブを分解することができる。

以下に、TanManプローブ法の流れを示す。

  1. PCRの反応溶液に、TaqManプローブを加えて増幅を行う。DNAポリメラーゼは、通常のものではなくTaq DNAポリメラーゼを用いる。
  2. TaqManプローブが、鋳型DNAに結合する。
  3. Taq DNAポリメラーゼがDNAを伸長する際に、TaqManプローブを分解する。
  4. FRET蛍光分子ペアが互いに解離し、クエンチされていた蛍光分子が発光するようになる。

TaqManプローブ法は、前述のSYBR Green法と異なり、目的遺伝子と特異的に結合するプローブを用いるため、より信頼性が高いデータが得られる。

3. qPCRのデータ分析

qPCRのデータは、以下のようなDNAの増幅曲線(= 蛍光強度)として得られる。段階希釈した既知量のDNAを標準サンプルとして用いることで、未知サンプルの定量ができる。

まず、増幅曲線において、一定の増幅量(閾値)に達するまでにかかったサイクル数(Ct値;threshold cycle)を調べる。このCt値を横軸に、標準サンプルの元の濃度を縦軸に、検量線プロットを作成する。得られた検量線と未知サンプルのCt値を照らし合わせることで、未知サンプルの濃度を調べることができる。

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大学院生。化学科、ケミカルバイオロジー専攻。趣味はスポーツで、アルティメットフリスビーにはまり中。

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